【正文】 過程，依據(jù)濾膜孔徑大小而達到物質(zhì)分離的目的。膜分離過程特別適合于性質(zhì)相似組分、同分異構體組分、熱敏性組分、生物物質(zhì)組分等混合物的分離。膜分離技術的類型和定義按膜分離粒子大小進行分類：167。微濾（MF）：以多孔細小薄膜為過濾介質(zhì)，壓力差為推動力，使不溶性物質(zhì)得以分離的操作，~14μm之間，主要用于微粒和細菌的過濾；167。超濾（UF）：分離介質(zhì)同上，但孔徑更小，~，分離推動力仍為壓力差，適合于分離酶、蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)；167。反滲透（RO）：是一種以壓力差為推動力，從溶液中分離出溶劑的膜分離操作，~ 之間；（由于分離的溶劑分子往往很小，不能忽略滲透壓的作用，故而稱為反滲透）。167。納濾（NF）：以壓力差為推動力，從溶液中分離300~1000小分子量的膜分離過程，孔徑分布在平均2nm，在氨基酸生產(chǎn)、抗生素回收等方面有廣泛應用。五、層析分離純化技術（一）層析法的基本原理層析法是利用混合物中各組分物理化學性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在兩相（一相為固定的，稱為固定相；另一相流過固定相，稱為流動相）中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動而達到分離的目的。（二）層析法的分類按兩相所處的狀態(tài)分為： 液相層析 液固層析 液液層析 氣相層析 氣固層析 氣液層析167。按層析過程的機理分類：吸附層析：利用吸附劑表面對不同組分吸附性能的差異，達到分離鑒定的目的。分配層析：利用不同組分在流動相和固定相之間的分配系數(shù)不同，使之分離。離子交換層析：利用不同組分對離子交換劑親和力的不同而分離。凝膠層析：利用某些凝膠對于不同分子大小的組分阻滯作用的不同，使不同組分分開。按操作形式不同分類：柱層析：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個方向移動而達到分離。紙層析：用濾紙做液體的載體，點樣后，用流動相展開，以達到分離鑒定的目的。薄層層析：將適當粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進行物質(zhì)的分離和鑒定。（三）吸附層析技術1吸附層析法（液固色譜法，LSC）基本原理利用固定相的固體吸附劑表面對不同組分吸附力的大小及洗脫液對它的溶解作用（解吸作用）的差異進行分離。 特點：適合分離不同種類的化合物(醇類和芳香烴)。2 吸附劑167。吸附劑是具有大表面積的活性多孔固體，與待分離物質(zhì)的極性官能團作用。167。常用的吸附劑有活性炭、硅石、氧化鋁、羥基磷灰石等。（四）分配層析技術原理：利用混合物在兩種不相混溶的液相（固定相和流動相）之間的分配系數(shù)的不同而達到分離各組分的目的。固定相液體均勻覆蓋于載體表面，流動相流過固定相。特點：液液層析法適合于分離同系物或同分異構體（五）凝膠過濾層析技術1基本原理概念（排阻層析，分子篩層析）：當生物大分子通過裝有凝膠顆粒的層析柱時，根據(jù)它們分子大小不同而進行分離的技術。原理：凝膠顆粒內(nèi)部具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構，被分離的混合物流過層析柱時，比凝膠孔徑大的分子不能進入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)過的路程較長移動速度較慢，最后被洗脫出來。2 凝膠的種類和性質(zhì)（1）交聯(lián)葡聚糖凝膠（商品名為Sephadex）（2）瓊脂糖凝（3）聚丙烯酰胺3 凝膠過濾在實驗室中的應用1）生物大分子物質(zhì)的分離純化 2）分子量的測定3）分級分離 4）溶液濃縮 5）細胞及顆粒的分離（六）離子交換層析法1原理：根據(jù)離子交換樹脂對需要分離的各種離子的親和力不同而達到分離的目的。離子交換樹脂通常是不溶于水的高分子物質(zhì)，可解離出H+，含有堿性可解離基團的稱為陰離子交換樹脂，可解離出OH。（七）親和層析法1原理：利用生物大分子間特異的親和能力來純化生物大分子，如：抗原和抗體；酶和底物或輔酶或抑制劑；激素和受體；RNA和其互補的DNA，金屬離子與氨基酸（如Ni2+與His）等。將待純化物質(zhì)的特異配體通過適當?shù)幕瘜W反應共價的連接到載體上，待純化的物質(zhì)可被配體吸附，雜質(zhì)則不被吸附，通過洗脫雜質(zhì)即可除去。被結(jié)合的物質(zhì)再用含游離的相應配體溶液把它從柱上洗脫下來。（八）高壓液相層析（HPLC）高壓液相層析也叫高效液相層析，因溶劑系統(tǒng)在高壓下操作，故稱高壓層析。從分離原理講，和前面講的離子交換層析、凝膠層析、親和層析等一樣，因此，高壓液相層析也可分為高壓離子交換層析、高壓凝膠層析等。與常規(guī)的柱層析相比，HPLC具有以下優(yōu)點：①分辨率高 ②速度快 ③ 靈敏度高 ④靈活性強，適應面廣六、萃取技術（一）概念 在含有被分離物質(zhì)的水溶液中，加入萃取劑和與水不相混溶的有機溶劑，震蕩，利用物質(zhì)在兩相中的分配不同的性質(zhì)，使一些組分進入有機相中，使另一些組分仍留在水相中，從而達到分離的目的。（二）原理 被分離組分在兩液相中的分配系數(shù)具有較大的差異。（三）特點 萃取具有選擇性好、回收率高、設備簡單、操作簡便、傳質(zhì)快，能耗低且生產(chǎn)能力大，周期短，便于連續(xù)操作、容易實現(xiàn)自動化等特點，因此一直受到廣泛重視。（四）溶劑選擇的原則①選擇一種對被分離物質(zhì)溶解度大而對雜質(zhì)溶解度小的溶劑，使被分離物質(zhì)從混合組分中有選擇性地分離；②選擇一對被分離物質(zhì)溶解度小而對雜質(zhì)溶解度大的溶劑，使雜質(zhì)分離；③溶劑的選擇原則：“相似相溶”；常見溶劑的極性大小順序：飽和烴類全氯代烴類不飽和烴類醚類未全氯代烴類酯類芳胺類酚類酮類醇類七、冷凍干燥技術（一）概念與特點 冷凍干燥又稱真空冷凍干燥或冷凍升華干燥，是指在低溫（ 60~20 ℃ ），將物料與溶液中的水分直接由冰晶體升華的干燥方法。 凍干適用于高度熱敏的生物制品，如酶、激素、疫苗等。凍干制劑應具有多孔性、疏松、易溶的特點，一般含水量在1%3%。但凍干設備投資及維護費用高，生產(chǎn)能力不大。（二）冷凍干燥的基本過程冷凍干燥工藝基本分為三個過程：預凍、一級干燥和二級干燥。第五章 代謝工程第一節(jié) 概述一、代謝工程的產(chǎn)生及沿革1 半個多世紀微生物生理與育種知識的累積2 基因工程理論和技術的成熟3 代謝流定量分析技術的發(fā)展代謝流量分析（ metabolic flux analysis）是一種研究胞內(nèi)代謝的方法，根據(jù)已有的代謝網(wǎng)絡的信息建立胞內(nèi)主要反應的化學計量模型和胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的質(zhì)量平衡，以實際測得的分泌到胞外的代謝中間產(chǎn)物的濃度，來推算代謝流量。4 生化工程在線檢測和建模方法的發(fā)展代謝控制發(fā)酵得以出現(xiàn)和發(fā)展、基因工程理論和技術的成熟、代謝流定量分析技術的發(fā)展、生化工程在線檢測和建模方法的發(fā)展最終使得代謝控制發(fā)酵學科的建立和發(fā)展。二、代謝工程的理論基礎（一）基本概念1. 微生物細胞能為其自身提供代謝能2. 細胞能量轉(zhuǎn)換機構的組成3. 微生物代謝中的電子流和電子回路4. 生物氧化和輔酶的再生5. 生化反應途徑和代謝途徑6. 生化反應網(wǎng)絡和代謝網(wǎng)絡7. 代謝網(wǎng)絡的聯(lián)網(wǎng)問題8. 代謝流和碳架物質(zhì)流9. 代謝主流“五段式”胞外營養(yǎng)物質(zhì)（一般要經(jīng)胞外酶降解后）從培養(yǎng)介質(zhì)跨膜進入細胞，（一般要）經(jīng)過“向心途徑”、“中心途徑”和“離心途徑”等三段連續(xù)的代謝途徑的代謝，才能在胞內(nèi)生成目的產(chǎn)物，最后，目的產(chǎn)物跨過細胞質(zhì)膜排出細胞回到培養(yǎng)介質(zhì)。因此，典型的理想載流途徑應該由以上五段承擔不同代謝分工的依次銜接的代謝途徑組成。這就是載流途徑的“五段式”。在這條載流途徑上流動的代謝主流對應地也有五段，這就是代謝主流的“五段式”。在“載流路徑” 、“代謝主流” 和“五段式” 等概念的基礎上，從統(tǒng)籌的角度出發(fā)，提出能作為一個整體用于設計育種以及發(fā)酵工藝控制的五字策略： “ 進、通、節(jié)、堵、出 ”。①進，促進細胞對碳源營養(yǎng)物質(zhì)的吸收；②通，使來自上游和各個注入分支的碳架物質(zhì)能暢通地流向目的產(chǎn)物；③節(jié)，阻塞與目的產(chǎn)物的形成無關或關系不大的代謝支流，使碳架物質(zhì)相對集中地流向目的產(chǎn)物；④堵，消除或削弱目的產(chǎn)物進一步代謝的途徑；⑤出，促進目的產(chǎn)物向胞外空間分泌?！? （定義）把量化代謝流及其控制的工程分析方法與根據(jù)分析結(jié)果制定的遺傳修飾方案付之實施的分子生物學技術結(jié)合起來，以反復分析、校驗和修正的方式進行實際操作，改善微生物的產(chǎn)物形成的能力和微生物的細胞性能，從而滿足人類對生物的特定需求的生物工程的分支。（二）代謝工程要解決的問題要解決的問題就是改變代謝途徑中的物質(zhì)流向，或者改變物質(zhì)流在不同途徑中的流量分布。（三）代謝工程的研究對象、目標與依據(jù)研究對象：代謝網(wǎng)絡；目標：修飾代謝過程——將代謝物質(zhì)流導入目的代謝產(chǎn)物的載流途徑，以獲得產(chǎn)物的最大轉(zhuǎn)化率；主要依據(jù)：對代謝節(jié)點的判斷。（四）代謝工程的實質(zhì)在于對物質(zhì)代謝的方向、流量及控制進行定量分析，并在此基礎上進行代謝過程改造，最大限度的提高目的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率。與傳統(tǒng)的誘變育種技術不同，它是一種有目的、有理性的改造，涉及生理學、分在生物學、生物化學等多門學科。（五）代謝工程理論涉及的內(nèi)容涉及生物化學原理、化學計量學、分子反應動力學、熱力學和控制學原理、酶學原理、分子生物學和分子遺傳學原理、細胞生物學原理、生化工程和化學工程的原理、基因組學、蛋白質(zhì)組學原理。三、代謝工程的研究概要代謝工程與所有傳統(tǒng)的工程領域一樣，代謝工程也包含 “分析” 和 “綜合” 兩個規(guī)定的步驟。代謝工程的一個基本目標是闡明代謝流控制的因素和機制，而系統(tǒng)研究代謝流及其控制機制有三大基本步驟：第一，建立一種盡可能多的觀察途徑并測定其流量的方法；第二，在代謝網(wǎng)絡中施加一個已知的擾動，以確定在系統(tǒng)達到新的穩(wěn)態(tài)時的代謝途徑；第三，系統(tǒng)分析代謝流的結(jié)果。代謝工程的多學科性質(zhì)決定了它的發(fā)展優(yōu)勢，同時也暗示了它在研究方法和技術方面的綜合性，主要可歸為三類：第一，檢測技術。第二，分析技術。第三，操作技術。四、代謝工程的研究技術與工具分子生物學工具、分析化學和測量工具、數(shù)學和計算機工具： 五、代謝工程的研究策略目前，代謝工程戰(zhàn)略思想主要有以下幾方面：（一）在現(xiàn)存途徑中提高目標產(chǎn)物的代謝流；（二）在現(xiàn)存途徑中改變物質(zhì)流的性質(zhì)；（三）利用已有途經(jīng)構建新的代謝旁路。六、代謝工程的重要應用和發(fā)展前景（一）代謝工程的主要應用領域：（二）代謝工程面臨的難題和發(fā)展展望第二節(jié) 逆代謝工程一、逆代謝工程的興起逆代謝工程定義：從限制生物活性的主要因素入手，在相關生物種類中鑒別所希望得到的表型，并確定該表型的決定基因，然后利用基因重組技術將該基因克隆到宿主菌中，并使之表達，使宿主菌得到所希望的表型的技術。傳統(tǒng)代謝工程的直線思維模式在改造復雜代謝網(wǎng)絡在遇到上述困難時已無能為力。許多研究者打破傳統(tǒng)，采用逆向思維模式創(chuàng)建了逆代謝工程思路：首先，在異源生物或相關模型系統(tǒng)中確定、推理或計算希望的表型；然后，確定導致這一表型的遺傳基因或特定的環(huán)境因子；最后，通過遺傳改造或環(huán)境改造使這一表型在特定的生物中表達。二、逆代謝工程的應用三、逆代謝工程的發(fā)展前景逆代謝工程研究的關鍵和難點：確定負責相關表型的基因，特別是依賴多基因的表型相關決定基因的確定。微生物和細胞培養(yǎng)積累的關于遺傳刺激表型反應的數(shù)據(jù)，以及標準微生物系統(tǒng)遺傳、生理和生物化學特性方面的深刻背景，加上高度自動化的現(xiàn)代分析工具，將基因和表型之間的相關性分析變得越來越容易。20