【正文】 離目的 方法：高價無機離子的去除方法，雜蛋白質的去除，發(fā)酵液的凝聚和絮凝。 數(shù)據(jù)檢測：純化工程中往往在進一步加工前需要測試在制品的某些指標的具體數(shù)值，根據(jù)測得的數(shù)據(jù)進行計算，確定下一道工序的工藝參數(shù)后才繼續(xù)加工，這種檢測即為數(shù)據(jù)檢測。 （4）成品制作 ：成品形式由產(chǎn)品的最終用途決定。 （2）初步分離 ：目的是除去與產(chǎn)物性質差異較大的雜質，為后來精制工序創(chuàng)造有利條件。 乙酸對生長和表達的影響第四章 微生物發(fā)酵產(chǎn)物的分離與純化第一節(jié) 分離純化策略一、建立分離純化工藝的根據(jù)（1）物理性質（2）化學性質（3）生物學性質二、分離純化的基本過程一般說來，分離純化的基本過程可分為4個階段：培養(yǎng)液(發(fā)酵液)的預處理和固液分離、初步純化(提取)、高度純化(精制)、成品加工。誘導時間對外源蛋白表達的影響誘導時間：加入誘導劑后的培養(yǎng)時間 隨著誘導時間的延長，外源蛋白的表達量增加，但外源蛋白在細胞內(nèi)的積累，對重組菌產(chǎn)生毒性，合成速率下降，甚至產(chǎn)物被分解。pH值對工程菌生長和表達的影響在相同通氣量和攪拌速度下，pH值對不同菌群生長影響不大，而對外源蛋白表達有一定影響。前期是菌體生長，生長到某一階段，加入誘導因子，誘發(fā)產(chǎn)物表達。為了抑制基因丟失的菌的生長，一般在培養(yǎng)中加入選擇壓力，如抗生素。 工程菌的獲得工程菌應具備的條件工程菌的應用：利用基因工程菌生產(chǎn)的特點v基因工程菌帶有外源基因，外源基因可能在質粒上也可能整合到染色體上，這些基因可能不穩(wěn)定。但這類方法只適用于小分子底物。交聯(lián)法：可得到高細胞濃度，但機械強度低，無法再生，不適于實際應用。共價法：操作穩(wěn)定性高。 六、固定化方法的比較吸附法：條件溫和、方法簡便、載體可再生。適用于多酶反應，特別是需要輔酶的反應。適用于一種酶催化的反應。四、固定化細胞的分類：微生物、動物、植物。是在酶固定化基礎上發(fā)展起來的一項技術。（五）共價偶聯(lián)法：利用酶表面的反應基團（如氨基、羧基、羥基、巰基、咪唑基）與活化的無機或有機載體反應，形成共價鍵將酶固定。酶分子 + 含有離子交換基團的固相載體 第一個離子結合法固定化酶：DEAE — Cellulose固定化過氧化氫酶 第一個工業(yè)化的固定化酶：DEAESephadex A50固定化氨基酰化酶（三）膠格包埋法：將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法。（二）吸附法1物理吸附法優(yōu)點：固定化時酶分子的構象很少或基本不發(fā)生變化。 五、固定化酶和固定化細胞發(fā)酵什么是固定化酶 ？固定化酶的優(yōu)缺點優(yōu)點：多次使用、可以裝塔連續(xù)反應、純化簡單、提高產(chǎn)物質量、應用范圍廣缺點：酶在固定化中易失活、首次投入成本高、大分子底物較困難制備固定化酶的方法（一）微型膠囊法：是將酶包埋在各種高分子聚合物制成的小球內(nèi)，制成固定化酶。 單菌固態(tài)純種發(fā)酵：是在純培養(yǎng)基礎上建立起來的，對于選育良種、保持生理活性和代謝過程中的穩(wěn)定起很大作用。 目前對于具有協(xié)同作用關系的菌株篩選和組合還是一個隨機過程的，缺乏有效的理論指導，而且對于已經(jīng)應用的混合培養(yǎng)體系也不能有效地協(xié)調(diào)菌間的關系，使其達最佳生態(tài)水平，發(fā)揮最大效應。 強化微生物混合固態(tài)發(fā)酵除應用于沼氣發(fā)酵、白酒發(fā)酵作用外，在石油采收、濕法冶金、食品發(fā)酵等領域同樣顯示其優(yōu)勢。典型的例子是傳統(tǒng)酒曲和醬油、腌萊、煙草發(fā)酵、茶葉發(fā)酵、青貯、堆肥等。（2）固態(tài)發(fā)酵的形式 固態(tài)發(fā)酵可分為自然富集固態(tài)發(fā)酵、強化微生物混合固態(tài)發(fā)酵、限定微生物混合固態(tài)發(fā)酵和單菌固態(tài)純種發(fā)酵。 固態(tài)發(fā)酵中微生物生長在缺乏或幾乎不可見液體水的顆粒之間，在固態(tài)發(fā)酵系統(tǒng)中，微生物可以從濕的基質顆粒中獲得所需的水分。 固態(tài)發(fā)酵是氣體作為生物反應過程中的OCO熱量、營養(yǎng)和產(chǎn)物的傳遞介質，表現(xiàn)為OCO2擴散比較容易，熱量傳遞困難，存在明顯的營養(yǎng)梯度，并且無大量有機廢水產(chǎn)生。從生物反應過程的本質考慮，固態(tài)發(fā)酵是以氣相為連續(xù)相的生物反應過程，而液態(tài)發(fā)酵是以液相為連續(xù)相的生物反應過程。（1）恒化培養(yǎng)：使培養(yǎng)基中限制性基質的濃度保持恒定；（2）恒濁培養(yǎng)：使培養(yǎng)基中菌體的濃度保持恒定。菌種發(fā)生變異的可能性較大；216。便于自動控制。控制稀釋速率可以使發(fā)酵過程最優(yōu)化，提高設備利用率和單位時間的產(chǎn)量；216。：216。由于有物料的加入增加了染菌機會。216。 補料—分批發(fā)酵的缺點216。和連續(xù)發(fā)酵比、不需要嚴格的無菌條件；216?？梢酝ㄟ^補料控制達到最佳的生長和產(chǎn)物合成條件；216。補料—分批發(fā)酵的優(yōu)點:216。 在此過程中只有料液的加入沒有料液的取出，所以發(fā)酵結束時發(fā)酵液體積比發(fā)酵開始時有所增加。缺點：非生產(chǎn)時間較長、設備利用率低，產(chǎn)率低，不適于測定動力學數(shù)據(jù)。對于初級代謝產(chǎn)物，在對數(shù)生長期初期就開始合成并積累，而次級代謝產(chǎn)物則在對數(shù)生長期后期和穩(wěn)定期大量合成。在這一過程中，除了空氣、消泡劑及控制pH的酸或堿外，培養(yǎng)基中接入菌種以后，沒有物料等任何其它物質的加入和取出。改變的主要參數(shù)有菌體繁殖代數(shù)、種子的形成、培養(yǎng)基的滅菌、通氣和攪拌，以及熱傳遞等3 放大的方法 從小規(guī)模的操作條件到大規(guī)模的放大過程，主要以單位體積輸入功率相等和保持K Lα值不變?yōu)榛A進行。菌體受傷導致核酸物質的漏失，進而影響菌體代謝。(3)菌絲受機械損傷的差異搖瓶培養(yǎng)時，菌體只受液體的沖擊或沿著瓶壁滑動的影響，機械損傷很小。(2)CO2濃度的差異發(fā)酵液中的CO2既可以隨空氣進入，又可以是菌體代謝產(chǎn)生的廢氣，CO2在水中的溶解度隨外界壓力的增大而增加。由于K d值不同，使各自培養(yǎng)液中溶解氧的濃度也不同、因而對菌體代謝會產(chǎn)生重要的影響。2 微生物搖瓶與發(fā)酵罐培養(yǎng)的差異及發(fā)酵罐規(guī)模改變的影響 搖瓶與罐培養(yǎng)的差異搖瓶與罐培養(yǎng)的差異可能有以下3個方面：(1)體積氧傳遞系數(shù)(K Lα)和溶解氧的差異微生物發(fā)酵多數(shù)是需氧發(fā)酵，而表示氧溶入培養(yǎng)液速度大小的溶氧系數(shù)K d值，隨搖瓶發(fā)酵與罐發(fā)酵、搖瓶裝料系數(shù)不同而不同。發(fā)酵過程的放大將實驗室和中試車間試驗所取得的研究結果應用到大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)中的過程稱之為放大(scale up)。：：實驗室階段：生產(chǎn)車間階段：：① 溫度 ② pH值 ③ 通氣攪拌 ④ 泡沫 發(fā)酵控制影響發(fā)酵的因素很多，如溫度、pH、通風、攪拌、罐壓力等等，必須適當?shù)乜刂朴绊懓l(fā)酵的各種條件，掌握發(fā)酵的動態(tài)，并進行雜菌的檢查和產(chǎn)物測定，使整個發(fā)酵過程順利進行。：： ①液體培養(yǎng)法：液體試管、三角瓶搖床震蕩或轉式培養(yǎng)； ②表面法培養(yǎng)：液體表層，包括茄子瓶、克氏瓶或瓷盤培養(yǎng)?？諝膺^濾介質空氣滅菌工藝過程補料液的滅菌發(fā)酵罐的滅菌種子擴大培養(yǎng)定義：種子擴大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴大培養(yǎng),最終獲得一定數(shù)量和質量的純種過程。氣流速度越大，慣性越大，截留效果越好?？諝獬怼＝橘|過濾：捕集粒子及各種微生物?？諝獬に嚢l(fā)酵對空氣的要求工業(yè)制備大量空氣的方法加熱滅菌：利用空氣壓縮時所產(chǎn)生的熱量除菌，無菌化程度不高的發(fā)酵過程。連續(xù)滅菌的特點1）高溫快速滅菌工藝，營養(yǎng)成分破壞的少；2）熱能利用合理，易于自動化控制3）不適合粘度大或固形物含量高的培養(yǎng)基滅菌；4）增加了連續(xù)滅菌設備及操作環(huán)節(jié)，增加染菌幾率。（2）連續(xù)滅菌操作：高溫短時滅菌操作，培養(yǎng)基在發(fā)酵罐外經(jīng)過一套滅菌設備連續(xù)的加熱滅菌，冷卻后送入已滅菌的發(fā)酵罐內(nèi)的工藝過程。營養(yǎng)成分損失較多，罐利用率低。特點：不需其他的附屬設備，操作簡便，手動。微生物濃度與滅菌時間成正比，濃度越高，滅菌時間越長。微生物的熱阻：是指微生物在某一特定條件（主要是溫度和加熱方式）下的致死時間。 致死溫度：殺死微生物的極限溫度。當微生物處于最低溫度以下時，代謝作用幾乎停止而處于休眠狀態(tài)。種類：紫外線等射線：局部空間 干熱滅菌：實驗室器皿 蒸汽滅菌：培養(yǎng)基效果好，操作方便，廣泛使用。應用：皮膚表面、器具、實驗室和工廠的無菌區(qū)域的臺面、地面、墻壁及空間的滅菌?；瘜W滅菌劑：氧化劑類等，鹵化物類，有機化合物等。消毒：用物理或化學方法殺死物料、容器、器皿內(nèi)外的病源微生物，達到無害化程度，%以上。工業(yè)規(guī)模的液體培養(yǎng)基滅菌，殺滅雜菌比除去雜菌更為常用。2污染：感染雜菌的培養(yǎng)或發(fā)酵體系。④ 所選用的培養(yǎng)基應能滿足總體工藝的要求，如不應該影響通氣、提取、純化及廢物處理等。② 發(fā)酵后所形成的副產(chǎn)物盡可能的少。 （5）水水源質量的主要考慮參數(shù)包括pH值、溶解氧、可溶性固體、污染程度以及礦物質組成和含量。 前體：指某些化合物加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接被微生物在生物合成過程中合成到產(chǎn)物分子中去，而其自身的結構并沒有多大變化，但是產(chǎn)物的產(chǎn)量卻因加入前體而有較大的提高。有機氮源成分復雜：除提供氮源外，有些有機氮源還提供大量的無機鹽及生長因子。常用的氮源可分為兩大類：有機氮源和無機氮源。注：不同碳源對微生物自身生長、發(fā)酵過程及產(chǎn)物會產(chǎn)生不同的影響。 ③ 淀粉、糊精缺點：難利用；發(fā)酵液比較稠、一般%時加入一定的α淀粉酶；成分比較復雜，有直鏈淀粉和支鏈淀粉等等。 來源：糖類、油脂、有機酸、正烷烴工業(yè)上常用的糖類：① 葡萄糖：所有的微生物都能利用葡萄糖，但是會引起葡萄糖效應； ② 糖蜜：糖蜜是制糖生產(chǎn)時的結晶母液，它是制糖工業(yè)的 副產(chǎn)物。滿足菌體的生長216。培養(yǎng)基的配制 ：廣義上講培養(yǎng)基是指一切可供微生物細胞生長、繁殖所需的一組營養(yǎng)物質和原料。第3章 發(fā)酵工藝第一節(jié) 微生物發(fā)酵的一般流程發(fā)酵概念：利用微生物，在適宜的條件下，將原料經(jīng)過特定的代謝途徑轉化為人類所需要的產(chǎn)物的過程。鑒定的方法有直接篩選法和分子生物學間接篩選法。但習慣上常把以噬菌體DNA為載體構建成的重組子導入細胞的過程統(tǒng)稱為轉染。一種是感染，即在體外將噬菌體DNA包裝成病毒顆粒，然后使其感染受體菌。 此外還可用電穿孔法轉化細菌，它的優(yōu)點是操作簡便、轉化效率高、適用于任何菌株。轉化：指以細菌質粒為載體，將外源基因導入受體細胞的過程。重組DNA分子導入宿主菌體外連接的重組DNA分子必須導入適當?shù)氖荏w細胞中才能大量的復制、增殖和表達。目的基因與載體DNA均采用限制性內(nèi)切酶處理，然后在DNA連接酶催化下，兩條雙鏈DNA片段相鄰的5’磷酸和3’羥基間形成磷酸二酯鍵，形成一個完整的有復制能力的環(huán)狀重組體。②能在受體細胞內(nèi)大量增殖，有較高的復制率；③最好只有一個限制性內(nèi)切酶的切口,使目的基因能固定地整合到載體DNA的一定位置上；④載體上必須有一種選擇性遺傳標記，如具有四環(huán)素、氨芐青霉素等的抗性基因,以便及時把極少數(shù)“工程菌”選擇出來。選擇載體載體（Vector）是攜帶目的基因并將其轉移至受體細胞內(nèi)復制和表達的運載工具。（五）基因工程育種：是指利用DNA重組技術將外源基因導入到微生物細胞，使后者獲得前者的某些優(yōu)良性狀或表達前者的基因產(chǎn)物而獲得新種。5．選擇性培養(yǎng)基上劃線生長，分離驗證，挑取融合子進一步試驗、保藏。3．等量原生質體加聚乙二醇促進融合。原生質體融合育種步驟：1．標記菌株的篩選和穩(wěn)定性驗證。擴大重組的親本范圍 原生質體由于完全或部分去除了細