【正文】 微生物和細胞培養(yǎng)積累的關于遺傳刺激表型反應的數據，以及標準微生物系統(tǒng)遺傳、生理和生物化學特性方面的深刻背景，加上高度自動化的現(xiàn)代分析工具，將基因和表型之間的相關性分析變得越來越容易。許多研究者打破傳統(tǒng)，采用逆向思維模式創(chuàng)建了逆代謝工程思路：首先，在異源生物或相關模型系統(tǒng)中確定、推理或計算希望的表型；然后，確定導致這一表型的遺傳基因或特定的環(huán)境因子；最后，通過遺傳改造或環(huán)境改造使這一表型在特定的生物中表達。六、代謝工程的重要應用和發(fā)展前景（一）代謝工程的主要應用領域：（二）代謝工程面臨的難題和發(fā)展展望第二節(jié) 逆代謝工程一、逆代謝工程的興起逆代謝工程定義：從限制生物活性的主要因素入手，在相關生物種類中鑒別所希望得到的表型，并確定該表型的決定基因，然后利用基因重組技術將該基因克隆到宿主菌中，并使之表達，使宿主菌得到所希望的表型的技術。第三，操作技術。代謝工程的多學科性質決定了它的發(fā)展優(yōu)勢，同時也暗示了它在研究方法和技術方面的綜合性，主要可歸為三類：第一，檢測技術。三、代謝工程的研究概要代謝工程與所有傳統(tǒng)的工程領域一樣，代謝工程也包含 “分析” 和 “綜合” 兩個規(guī)定的步驟。與傳統(tǒng)的誘變育種技術不同，它是一種有目的、有理性的改造，涉及生理學、分在生物學、生物化學等多門學科。（三）代謝工程的研究對象、目標與依據研究對象：代謝網絡；目標：修飾代謝過程——將代謝物質流導入目的代謝產物的載流途徑，以獲得產物的最大轉化率；主要依據：對代謝節(jié)點的判斷?！? （定義）把量化代謝流及其控制的工程分析方法與根據分析結果制定的遺傳修飾方案付之實施的分子生物學技術結合起來，以反復分析、校驗和修正的方式進行實際操作，改善微生物的產物形成的能力和微生物的細胞性能，從而滿足人類對生物的特定需求的生物工程的分支。在“載流路徑” 、“代謝主流” 和“五段式” 等概念的基礎上，從統(tǒng)籌的角度出發(fā)，提出能作為一個整體用于設計育種以及發(fā)酵工藝控制的五字策略： “ 進、通、節(jié)、堵、出 ”。這就是載流途徑的“五段式”。二、代謝工程的理論基礎（一）基本概念1. 微生物細胞能為其自身提供代謝能2. 細胞能量轉換機構的組成3. 微生物代謝中的電子流和電子回路4. 生物氧化和輔酶的再生5. 生化反應途徑和代謝途徑6. 生化反應網絡和代謝網絡7. 代謝網絡的聯(lián)網問題8. 代謝流和碳架物質流9. 代謝主流“五段式”胞外營養(yǎng)物質（一般要經胞外酶降解后）從培養(yǎng)介質跨膜進入細胞，（一般要）經過“向心途徑”、“中心途徑”和“離心途徑”等三段連續(xù)的代謝途徑的代謝，才能在胞內生成目的產物，最后，目的產物跨過細胞質膜排出細胞回到培養(yǎng)介質。第五章 代謝工程第一節(jié) 概述一、代謝工程的產生及沿革1 半個多世紀微生物生理與育種知識的累積2 基因工程理論和技術的成熟3 代謝流定量分析技術的發(fā)展代謝流量分析（ metabolic flux analysis）是一種研究胞內代謝的方法，根據已有的代謝網絡的信息建立胞內主要反應的化學計量模型和胞內代謝產物的質量平衡，以實際測得的分泌到胞外的代謝中間產物的濃度，來推算代謝流量。但凍干設備投資及維護費用高，生產能力不大。 凍干適用于高度熱敏的生物制品，如酶、激素、疫苗等。（三）特點 萃取具有選擇性好、回收率高、設備簡單、操作簡便、傳質快，能耗低且生產能力大，周期短，便于連續(xù)操作、容易實現(xiàn)自動化等特點，因此一直受到廣泛重視。與常規(guī)的柱層析相比，HPLC具有以下優(yōu)點：①分辨率高 ②速度快 ③ 靈敏度高 ④靈活性強，適應面廣六、萃取技術（一）概念 在含有被分離物質的水溶液中，加入萃取劑和與水不相混溶的有機溶劑，震蕩，利用物質在兩相中的分配不同的性質，使一些組分進入有機相中，使另一些組分仍留在水相中，從而達到分離的目的。（八）高壓液相層析（HPLC）高壓液相層析也叫高效液相層析，因溶劑系統(tǒng)在高壓下操作，故稱高壓層析。將待純化物質的特異配體通過適當的化學反應共價的連接到載體上，待純化的物質可被配體吸附，雜質則不被吸附，通過洗脫雜質即可除去。離子交換樹脂通常是不溶于水的高分子物質，可解離出H+，含有堿性可解離基團的稱為陰離子交換樹脂，可解離出OH。原理：凝膠顆粒內部具有多孔網狀結構，被分離的混合物流過層析柱時，比凝膠孔徑大的分子不能進入凝膠孔內，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來；比網孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠孔內外，在柱內經過的路程較長移動速度較慢，最后被洗脫出來。固定相液體均勻覆蓋于載體表面，流動相流過固定相。常用的吸附劑有活性炭、硅石、氧化鋁、羥基磷灰石等。吸附劑是具有大表面積的活性多孔固體，與待分離物質的極性官能團作用。 特點：適合分離不同種類的化合物(醇類和芳香烴)。薄層層析：將適當粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進行物質的分離和鑒定。按操作形式不同分類：柱層析：將固定相裝于柱內，使樣品沿一個方向移動而達到分離。離子交換層析：利用不同組分對離子交換劑親和力的不同而分離。按層析過程的機理分類：吸附層析：利用吸附劑表面對不同組分吸附性能的差異，達到分離鑒定的目的。五、層析分離純化技術（一）層析法的基本原理層析法是利用混合物中各組分物理化學性質的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數等），使各組分在兩相（一相為固定的，稱為固定相；另一相流過固定相，稱為流動相）中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動而達到分離的目的。167。超濾（UF）：分離介質同上，但孔徑更小，~，分離推動力仍為壓力差，適合于分離酶、蛋白質等生物大分子物質；167。膜分離技術的類型和定義按膜分離粒子大小進行分類：167。膜分離技術的特點：膜分離過程的實質是物質透過或被截留于膜的過程，近似于篩分過程，依據濾膜孔徑大小而達到物質分離的目的。四、膜分離純化技術167。這種方法適用于分離大小相近而密度不同的樣品，如DNA、RNA的分離。樣品被置于一個較陡峭的密度梯度中沉降，該梯度的最大密度高于樣品混合物的最大密度，梯度的最小密度低于樣品混合物的最小密度，當樣品顆粒沿梯度運動到與顆粒的浮力密度相同的密度層時，就停止運動，這樣經過一段較長時間的離心，樣品中所有不同密度的顆粒就都將在各自的等密度區(qū)域中停止運動，從而分布在不同的密度梯度區(qū)域，即顆粒根據各自的浮力密度進行分級分離。常用介質：蔗糖、甘油等。密度梯度系統(tǒng)的選擇：梯度介質有足夠大的溶解度，不與分離組分反應，不會引起分離組分的凝集、變性或失活。這種方法適用于分離密度相似而大小有別的樣品。離心一定時間后不同大小的顆粒將沉降在不同的層次，產生所謂區(qū)帶。 2 速度區(qū)帶離心也常稱為密度梯度離心。其他轉頭其中常見的主要是前三種類型的轉頭。區(qū)帶轉頭167。甩平轉頭167。（二）各型離心機的性能及適用范圍 按轉速可分為轉速分：常速（低速）、高速和超速（三）離心機雜轉頭的類型及適用范圍 離心機的轉頭主要有以下幾種類型：167。細胞的收集、細胞碎片和沉淀的分離等常用離心分離。216。優(yōu)點：很多蛋白質的等電點都在偏酸性范圍內，而無機酸通常價較廉，并且某些酸，如磷酸、鹽酸和硫酸的應用能為蛋白質類食品所允許。蛋白質是兩性電解質，當溶液pH值處于等電點時，分子表面凈電荷為0，雙電層和水化膜結構被破壞，由于分子間引力，形成蛋白質聚集體，進而產生沉淀。金屬離子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+（三）等電點沉淀概念：調節(jié)體系pH值，使兩性電解質的溶解度下降，析出的操作稱為等電點沉淀。?。喝軇┯昧看?，回收率低，但共沉淀作用小167。離子強度:離子強度低有利于沉析，~167。溶液pH值：原則是避免目標蛋白與雜質帶有相反的電荷，防止共沉現(xiàn)象。溫度：低溫有利于防止溶質變性；有利于提高收率（溶解度下降）；167。 特點：介電常數小，60%乙醇的介電常數是48，丙酮的介電常數是22；容易獲取有機溶劑沉析的特點：分辨率高；溶劑容易分離，并可回收使用；產品潔凈；容易使蛋白質等生物大分子失活，應注意在低溫下操作；成本高溶劑選擇：介電常數要小，致變性作用要小，毒性要小、揮發(fā)性適中，水溶性要好，有機溶劑沉淀蛋白質的能力隨蛋白質種類及有機溶劑的種類而異。（2）由于有機溶劑的水合作用，降低了自由水的濃度，降低了親水溶質表面水化層的厚度，降低了親水性，導致脫水凝聚。 ①溶質濃度的影響：蛋白質濃度大，鹽的用量小，但共沉作用明顯，分辨率低；蛋白質濃度小，鹽的用量大，分辨率高；②pH值：影響蛋白質表面凈電荷的數量：通常調整體系pH值，使其在pI附近；③鹽析溫度：一般在高鹽濃度下，溫度升高，其溶解度反而下降④溶質種類的影響：（二）有機溶劑沉淀概念：在含有溶質的水溶液中加入一定量親水的有機溶劑，降低溶質的溶解度，使其沉淀析出。 （2）選擇中性鹽應注意的問題鹽析作用要強，使酶沉淀完全、收率高；鹽析用鹽必須是惰性的，有利于酶的提純，而本身又易去除；對酶無毒性，應用不受影響；來源豐富、價格低廉；廢水處理容易。 ：通過破壞蛋白質分子表面水膜或中和蛋白質分子表面水膜使蛋白質凝聚沉淀。種類：鹽析、有機溶劑沉析、等電點沉析等。缺點：針對復雜體系而言，分離度不高、選擇性不強，沉淀物中含有大量的鹽析劑。優(yōu)點：操作簡單、經濟、濃縮倍數高、收率高(不會使蛋白質等大分子失活)。 1. 微生物細胞的破碎技術 常見的細胞破碎方法有：機械方法（珠磨法、高壓勻漿器、Xpress法、超聲波破碎）和非機械方法（酶解法、滲透壓沖擊、凍結和融化、干燥法、化學法）常見的細胞破碎方法分類作用機理適應性機械法珠磨法固體剪切作用可達較高破碎率，可較大規(guī)模操作，大分子目標產物易失活，漿液分離困難高壓勻漿法液體剪切作用可達較高破碎率，可大規(guī)模操作，不適合絲狀菌和革蘭氏陽性菌超聲波破碎法液體剪切作用對酵母菌效果較差，破碎過程升溫劇烈，不適合大規(guī)模操作Xpress固體剪切作用破碎率高，活性保留率高，對冷凍敏感的目標產物不適應非機械法酶溶法酶分解作用具有高度專一性，條件溫和，漿液易分離，溶解酶價格高，適用性差化學滲透法改變細胞膜的滲透性具有一定選擇性，漿液易分離，但釋放率較低，適用性差滲透壓法滲透壓劇烈改變破碎率較低，常與其它方法結合使用凍融法反復凍結融化破碎率較低，不適合對冷凍敏感的目標產物干燥法改變細胞膜滲透性條件變化劇烈，易引起大分子物質失活化學法細胞溶解或組分外滲容易引起生化物質破壞，還會帶來分離和回收化學物質的問題二、沉淀分離純化技術 定義：利用沉淀劑使所需提取的生化物質或雜質在溶液中的溶解度降低而形成無定形固體沉淀的過程。還有許多是存在于細胞內，例如青霉素?；福瑝A性磷酸酯酶等，稱為胞內產物。（3）常用的絮凝劑：聚丙烯酰胺、聚乙烯亞胺、聚胺衍生物、氯化鈣、磷酸氫二鈉。絮凝是指在某些高分子絮凝劑存在下，基于架橋作用，使膠粒形成粗大的絮凝團的過程，是一種以物理的集合為主的過程。（3）鐵離子，可加入黃血鹽，使形成普魯士藍沉淀。（2）鎂離子，可用三聚磷酸鈉和鎂離子形成可溶性絡合物，用磷酸鹽處理，也能大大降低鈣離子和鎂離子的濃度。草酸溶解度較小，故用量大時，可用其可溶性鹽，如草酸鈉。第二節(jié) 分離純化技術一、細胞破碎技術（一）發(fā)酵液的預處理和固液分