【正文】 料迅速殺死，并使染色體形態(tài)、結(jié)構(gòu)盡可能保持不變和便于染色。解離 常用酸解法：從70％乙醇中取出固定好的根尖→流水沖洗３min→吸水紙吸干→放入盛有適量1 mol/L HCl，60177?！嫠”氐那嗝顾仄恐小怆x10min。染色 改良石炭酸品紅染色：解離后材料水洗3min并吸干，取1/2個(gè)根尖的乳白色分生組織于載玻片上夾碎搗爛，滴加1～2滴染液，染色10～15min，壓片。壓片 在經(jīng)染色的材料上加一滴染液，蓋上蓋玻片，覆一層吸水紙，用帶橡皮頭的鉛筆垂直敲打，或以拇指垂直緊壓蓋片(注意勿使蓋片搓動(dòng))，使材料分散壓平，便于觀察。鏡檢 通常染色清晰而又分散得很好的分裂相只是少數(shù)，因此壓片后要認(rèn)真仔細(xì)地進(jìn)行鏡檢。先在低倍鏡下尋找有分裂相的視野，再用高倍鏡仔細(xì)觀察、記數(shù)或拍照。調(diào)節(jié)可調(diào)節(jié)可變光欄與反光鏡，使光線明暗合適，視場(chǎng)亮度適中。注意觀察有絲分裂全過程的染色體形態(tài)變化，找出染色體分散好的中期細(xì)胞進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，對(duì)好的分裂圖像作上標(biāo)記，以便再觀察。封片保存如制片標(biāo)本符合要求，則把玻片放在干冰或冰箱中凍結(jié)，然后用刀片迅速把蓋玻片和載玻片分開，用電吹風(fēng)吹干玻片，經(jīng)二甲苯透明后，滴中性樹膠，加蓋玻片封片，制成永久制片。制作完成的制片標(biāo)本要貼上標(biāo)簽，注明材料名稱、可觀察到的有絲分裂典型時(shí)期、制片時(shí)間、制作者等信息。 【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】間期：在光學(xué)顯微鏡下，只看到均勻一致的細(xì)胞核及許多的絲狀染色質(zhì)。實(shí)質(zhì)上間期的核是處于高度活躍的生理生化的代謝階段，正為細(xì)胞分裂準(zhǔn)備條件。前期：核內(nèi)染色質(zhì)逐漸濃縮為細(xì)長(zhǎng)而卷曲的染色體，每一染色體含有兩個(gè)染色單體，它們具有一個(gè)共同的著絲點(diǎn)；核仁和核膜逐漸模糊不明顯。中期：核仁、核膜逐漸消失，各染色體排列在赤道板上，紡錘絲與染色體的著絲點(diǎn)相連。染色體分散，易于鑒定形態(tài)、數(shù)目。后期：各染色體著絲點(diǎn)分裂為二，其每條染色單體也相應(yīng)地分開，并各自隨著紡錘絲的收縮而移向兩極，每極有一組染色體，數(shù)目和原來的相同。末期：分開在兩極的染色體各自組成新的細(xì)胞核，在細(xì)胞質(zhì)中央赤道板處形成新的細(xì)胞壁，使細(xì)胞分裂為二，形成二個(gè)子細(xì)胞。這時(shí)細(xì)胞進(jìn)入分裂間期。 【實(shí)驗(yàn)報(bào)告】制作細(xì)胞有絲分裂前、中、后、末各期的制片一張，中期應(yīng)能數(shù)清染色體數(shù)。貼上標(biāo)簽，注明材料名稱，染色方法，制片日期和制作者姓名。繪制所觀察到有絲分裂典型時(shí)期的染色體圖像，并簡(jiǎn)要說明各時(shí)期染色體的行為變化和特征。十四、蠶豆根尖微核檢測(cè)技術(shù)【目的要求】了解微核測(cè)試的原理及其在實(shí)際生活與工作中的應(yīng)用范圍及意義；學(xué)習(xí)蠶豆根尖的微核測(cè)試技術(shù)?！净驹怼课⒑撕?jiǎn)稱（MCN)，是真核生物細(xì)胞中的一種異常結(jié)構(gòu)，往往是細(xì)胞經(jīng)輻射或化學(xué)藥物的作用而產(chǎn)生。在細(xì)胞間期微核呈圓形或橢圓形，游離于主核之外、大小應(yīng)在主核1／3 以下。微核的折光率及細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)性質(zhì)和主核一樣。一般認(rèn)為微核是由有絲分裂后期喪失著絲粒的斷片產(chǎn)生的，但有些實(shí)驗(yàn)也證明整條的染色體或多條染色體也能形成微核。這些斷片或染色體在細(xì)胞分裂末期被兩個(gè)子細(xì)胞核所排斥便形成了第三個(gè)核塊。已經(jīng)證實(shí)微核率的大小是和用藥的劑量或輻射累積效應(yīng)呈正相關(guān)，這一點(diǎn)和染色體畸變的情況一樣。所以可用簡(jiǎn)易的間期微核計(jì)數(shù)來代替繁雜的中期畸變?nèi)旧w計(jì)數(shù)。由于大量新的化合物的合成，原子能應(yīng)用，各種各樣工業(yè)廢物的排出，使人們很需要有一套高度靈敏，技術(shù)簡(jiǎn)單的測(cè)試系統(tǒng)來監(jiān)視環(huán)境的變化。只有真核的測(cè)試系統(tǒng)更能直接推測(cè)誘變物質(zhì)對(duì)人類或其它高等生物的遺傳危害，在這方面，微核測(cè)試是一種比較理想的方法。且有研究顯示以植物進(jìn)行微核測(cè)試與以動(dòng)物進(jìn)行的一致率可達(dá)99%以上。目前微核測(cè)試已經(jīng)廣泛應(yīng)用于輻射損傷、輻射防護(hù)、化學(xué)誘變劑、新藥試驗(yàn)、染色體遺傳疾病及癌癥前期診斷等各方面 利用蠶豆根尖作為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行微核測(cè)試，可準(zhǔn)確的顯示各種處理誘發(fā)畸變的效果，并可用于污染程度的監(jiān)測(cè)。利用蠶豆初生根尖細(xì)胞微核（micronucleus, MN)技術(shù)監(jiān)側(cè)水環(huán)境，系國(guó)內(nèi)外的一種新的生物學(xué)測(cè)試系統(tǒng)。本檢測(cè)法的立論根據(jù)是：動(dòng)物、植物和人的外周血淋巴細(xì)胞等受到致突變物處理后都有增加微核的趨勢(shì)，并且它們的定性反應(yīng)一致性可達(dá)99％以上。此項(xiàng)技術(shù)簡(jiǎn)便、易行、費(fèi)用低，適用于河流湖泊、水庫、池塘以及各種工礦企業(yè)廢水、生活污水中所含致突變物的監(jiān)測(cè)。【實(shí)驗(yàn)用品】實(shí)驗(yàn)材料松滋青皮豆（普通蠶豆代替） 蠶豆根尖細(xì)胞的染色體大，DNA 含量多，因而對(duì)誘變物反應(yīng)敏感。松滋青皮豆是華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳學(xué)教研室從蠶豆不同品種中篩選出來的微核試驗(yàn)敏感品種。本品種栽培繁殖時(shí)要注意不和其它蠶豆品種種在一起，不噴農(nóng)藥，以保持該品種較低的本底微核值。如果只需對(duì)水環(huán)境的監(jiān)測(cè)起警報(bào)系統(tǒng)作用，也可用其它當(dāng)?shù)匦Q豆品種，但要注意設(shè)好對(duì)照組。種子成熟曬干后，為保證其發(fā)芽率，要貯于干燥器內(nèi)，或用牛皮紙袋裝好放人4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?．器材顯微鏡、溫箱、恒溫水浴鍋、冰箱、手掀計(jì)數(shù)器、解剖盤（或鋁制飯盒）、鑷子、解剖針、載玻片、蓋玻片、試劑瓶、燒杯等顯微壓片實(shí)驗(yàn)用具。3．藥品1）5 mol/L HC1。2）卡諾氏液：無水乙醇（或95％乙醉)3 份加冰醋酸1 份配成。固定根尖時(shí)隨用隨配。3）席夫氏（Schiff）試劑：稱0. 5 g 堿性品紅（Fuchsin Basic)加蒸餾水100 ml 置三角燒瓶中煮沸5 min，并不斷攪拌使之溶解。冷卻到58℃時(shí)過濾于深棕色試劑瓶中，待濾液冷至25 ℃時(shí)再加人10 ml 1 mol/lHCl 和1 g 偏重亞硫酸鈉或偏重亞硫酸鉀（Na2S2O5 或K2S2O5）充分振蕩使其溶解。塞緊瓶口，用黑紙包好，置于暗處至少24 h，檢查染色液如果是透明無色即可使用。此染色液在4℃冰箱中可保存6個(gè)月左右，如出現(xiàn)沉淀就不能再用。4）SO2 洗滌液貯存液：10% Na2S2O5（或K2S2O5)溶液，1 mol/L HCI使用液：取上述10% Na2S2O5（或K2S2O5)溶液 5 m，加1mol/l HCl 5 ml，再加蒸餾水100 ml 配成，現(xiàn)用現(xiàn)配?！痉椒ú襟E】蠶豆浸種催芽1) 浸種 將當(dāng)年或前一年的蠶豆種子按需要量放人盛有自來水（或蒸餾水）的燒杯中，置25 ℃的溫箱內(nèi)浸泡24 h－36 h，此期間至少換水2 次，換用的水最好事先置于 25 ℃溫箱中預(yù)溫。（如室溫超過25℃，即可在室溫下進(jìn)行浸種催芽。）2) 催芽 待種子吸脹后，用紗布松松包裹置解剖盤（或鋁盒）內(nèi)，保持濕度，在25 ℃的溫箱中催芽12 h－24 h，待種子初生根露出2 mm－3 mm 時(shí)，選取發(fā)芽良好的種子，放人鋪有薄層濕脫脂棉的解剖盤（或鋁盒）內(nèi)，仍置人25 ℃的溫箱中繼續(xù)催芽，注意保持濕度。再經(jīng)36 h－48 h，種子大部分初生根長(zhǎng)至1. 5 cm－2 cm，根毛發(fā)育良好，這時(shí)就可用來作為監(jiān)側(cè)水源樣品或檢測(cè)藥物溶液誘變效應(yīng)之用。被監(jiān)測(cè)液處理根尖1) 每一處理選取6 粒－8 粒初生根尖生長(zhǎng)良好、根長(zhǎng)較一致的種子，放人盛有被測(cè)液的培養(yǎng)皿中，讓被測(cè)液浸泡住根尖即可。用自來水（或蒸餾水）處理作對(duì)照，方法相同。2) 處理時(shí)間4 h－6 h，視實(shí)驗(yàn)要求和被測(cè)液的濃度等情況而定。根尖細(xì)胞修復(fù)培養(yǎng)1) 將處理后的種子，用自來水（或蒸餾水）浸洗3 次，每次2 min－3 min。2) 洗凈后的種子再放人新鋪好的濕脫脂棉的解剖盤（或鋁盒）內(nèi)，按前述培養(yǎng)條件使根尖細(xì)胞修復(fù)22 h－24 h，亦可在培養(yǎng)皿中用自來水浸住根尖修復(fù)培養(yǎng)。固定根尖細(xì)胞1) 將修復(fù)培養(yǎng)后的豆子，從根尖頂端切下1 cm 長(zhǎng)的幼根放人空青霉素瓶中，加卡諾氏固定液固定24 h－48 h。2) 固定后的幼根如不及時(shí)制片，可換人70％的乙醇中，置4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。孚爾根（Feulgen）染色1）固定好的幼根，在青霉素瓶中用蒸餾水浸洗2 次，每次5 min。2) 吸凈蒸餾水，再加人5 mol/L HCl 將幼根泡住，連瓶放人28℃水浴鍋中水解幼根25 min 左右，視根軟化的程度可適當(dāng)增減時(shí)間，當(dāng)幼根被軟化即可。3) 用蒸餾水浸洗幼根2 次，每次5min。4) 在暗室或遮光的條件下加席夫（Schiff）試劑，每瓶用量以淹住幼根液面高出2 mm 為好。在遮光條件下染色過夜（約12h）。5) 除去染液，用SO2 洗滌液浸洗幼根2 次，每次5 min,6）用蒸餾水浸洗一次，5 min。7) 將幼根放人新?lián)Q的蒸餾水中，置4 ℃ 冰箱內(nèi)保存，可供隨時(shí)制片之用。制片1) 將幼根放在擦凈的載玻片上，用解剖針截下1 mm 左右的根尖。2) 滴上少許蒸餾水或45％的醋酸溶液，用解剖針將根尖搗碎。3) 加蓋一清潔的蓋玻片，注意不要有氣泡。4）在蓋玻片上加一小塊濾紙，用左手食指壓住蓋玻片一角，右手用鉛筆上的橡皮頭一端敲打壓片，切勿讓蓋玻片與載玻片之間滑動(dòng)。鏡檢及微核識(shí)別標(biāo)準(zhǔn)將制片先置低倍顯微鏡下找到分生組織區(qū)細(xì)胞分散均勻、膨大、分裂相較多的部位，再轉(zhuǎn)到高倍鏡（物鏡40X）下進(jìn)行觀察。附：微核識(shí)別的標(biāo)準(zhǔn)：1) 凡是主核大小的1/3 以下，并與主核分離的小核； 2）小核著色與主核相當(dāng)或稍淺；3) 小核形態(tài)可為圓形、橢圓形、不規(guī)則形等。凡符合以上三條的小核就是微核。每一處理觀察3 個(gè)－5 個(gè)根尖，每個(gè)根尖計(jì)數(shù)1 000 個(gè)細(xì)胞中的微核數(shù)?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】將微核觀察記載表上所得數(shù)據(jù)，按如下步驟進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。各測(cè)試樣品（包括對(duì)照組）微核千分率（MN ‰）的計(jì)算為：某測(cè)試樣點(diǎn)（或?qū)φ眨┯^察到的MN 數(shù)MN‰＝——————————————————— X 1 000‰某測(cè)試樣點(diǎn)（或?qū)φ眨┯^察的細(xì)胞數(shù) 如果被監(jiān)測(cè)的樣品不多，可直接用各樣品MN 千分率平均值與對(duì)照比較（t 檢驗(yàn)），從差異的顯著性判斷水質(zhì)污染與否。 如被監(jiān)測(cè)的樣品較多，可先用方差分析（F 檢驗(yàn)）看各采樣點(diǎn)（或各樣品）所出現(xiàn)的MN 千分率平均值和對(duì)照組差異的顯著性。如差異顯著，還可進(jìn)行各采樣點(diǎn)微核差異顯著性的多重比較，看被檢測(cè)樣品的MN 千分率平均值差異顯著性的分組情況，以歸納劃分這些不同采樣點(diǎn)不同級(jí)別的污染程度。4．如采用已篩選出的、專門隔離栽培、無污染的松滋青皮豆作實(shí)驗(yàn)材料，并按規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)條件（其對(duì)照本底MN‰為10‰以下），其監(jiān)測(cè)樣品污染程度的劃分，可不用上述（2)、（3)兩種統(tǒng)計(jì)處理方法，而直接采用如下標(biāo)準(zhǔn)：1) MN ‰ 在10 ‰ 以下為基本無污染；10 ‰－18 ‰ 區(qū)間為輕度污染；18‰－30‰?yún)^(qū)間為中度污染；30‰ 以上為嚴(yán)重污染。2) “污染指數(shù)（pollution index）”判別此方法可避免因?qū)嶒?yàn)條件等因素帶來的MN‰本底的波動(dòng)，故較宜適用。樣品實(shí)測(cè)MN‰平均值污染指數(shù)（PI）＝——————————————— 標(biāo)準(zhǔn)水（對(duì)照組）MN‰平均值附：蠶豆根尖微核檢測(cè)記錄表試驗(yàn)號(hào) 鏡檢日期 鏡檢者【實(shí)驗(yàn)報(bào)告】以小組為單位整理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，撰寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告；每人寫一份實(shí)驗(yàn)心得體會(huì)。