【正文】 料迅速殺死，并使染色體形態(tài)、結(jié)構(gòu)盡可能保持不變和便于染色。解離 常用酸解法：從70％乙醇中取出固定好的根尖→流水沖洗３min→吸水紙吸干→放入盛有適量1 mol/L HCl，60177。℃水浴保溫的青霉素瓶中→解離10min。染色 改良石炭酸品紅染色：解離后材料水洗3min并吸干，取1/2個根尖的乳白色分生組織于載玻片上夾碎搗爛，滴加1～2滴染液，染色10～15min，壓片。壓片 在經(jīng)染色的材料上加一滴染液，蓋上蓋玻片，覆一層吸水紙，用帶橡皮頭的鉛筆垂直敲打，或以拇指垂直緊壓蓋片(注意勿使蓋片搓動)，使材料分散壓平，便于觀察。鏡檢 通常染色清晰而又分散得很好的分裂相只是少數(shù)，因此壓片后要認真仔細地進行鏡檢。先在低倍鏡下尋找有分裂相的視野，再用高倍鏡仔細觀察、記數(shù)或拍照。調(diào)節(jié)可調(diào)節(jié)可變光欄與反光鏡，使光線明暗合適，視場亮度適中。注意觀察有絲分裂全過程的染色體形態(tài)變化，找出染色體分散好的中期細胞進行染色體計數(shù)，對好的分裂圖像作上標記，以便再觀察。封片保存如制片標本符合要求，則把玻片放在干冰或冰箱中凍結(jié)，然后用刀片迅速把蓋玻片和載玻片分開，用電吹風吹干玻片，經(jīng)二甲苯透明后，滴中性樹膠，加蓋玻片封片，制成永久制片。制作完成的制片標本要貼上標簽，注明材料名稱、可觀察到的有絲分裂典型時期、制片時間、制作者等信息。 【實驗結(jié)果】間期：在光學顯微鏡下，只看到均勻一致的細胞核及許多的絲狀染色質(zhì)。實質(zhì)上間期的核是處于高度活躍的生理生化的代謝階段，正為細胞分裂準備條件。前期：核內(nèi)染色質(zhì)逐漸濃縮為細長而卷曲的染色體，每一染色體含有兩個染色單體，它們具有一個共同的著絲點；核仁和核膜逐漸模糊不明顯。中期：核仁、核膜逐漸消失，各染色體排列在赤道板上，紡錘絲與染色體的著絲點相連。染色體分散，易于鑒定形態(tài)、數(shù)目。后期：各染色體著絲點分裂為二，其每條染色單體也相應地分開，并各自隨著紡錘絲的收縮而移向兩極，每極有一組染色體，數(shù)目和原來的相同。末期：分開在兩極的染色體各自組成新的細胞核，在細胞質(zhì)中央赤道板處形成新的細胞壁，使細胞分裂為二，形成二個子細胞。這時細胞進入分裂間期。 【實驗報告】制作細胞有絲分裂前、中、后、末各期的制片一張，中期應能數(shù)清染色體數(shù)。貼上標簽，注明材料名稱，染色方法，制片日期和制作者姓名。繪制所觀察到有絲分裂典型時期的染色體圖像，并簡要說明各時期染色體的行為變化和特征。十四、蠶豆根尖微核檢測技術(shù)【目的要求】了解微核測試的原理及其在實際生活與工作中的應用范圍及意義；學習蠶豆根尖的微核測試技術(shù)?！净驹怼课⒑撕喎Q（MCN)，是真核生物細胞中的一種異常結(jié)構(gòu)，往往是細胞經(jīng)輻射或化學藥物的作用而產(chǎn)生。在細胞間期微核呈圓形或橢圓形，游離于主核之外、大小應在主核1／3 以下。微核的折光率及細胞化學反應性質(zhì)和主核一樣。一般認為微核是由有絲分裂后期喪失著絲粒的斷片產(chǎn)生的，但有些實驗也證明整條的染色體或多條染色體也能形成微核。這些斷片或染色體在細胞分裂末期被兩個子細胞核所排斥便形成了第三個核塊。已經(jīng)證實微核率的大小是和用藥的劑量或輻射累積效應呈正相關，這一點和染色體畸變的情況一樣。所以可用簡易的間期微核計數(shù)來代替繁雜的中期畸變?nèi)旧w計數(shù)。由于大量新的化合物的合成，原子能應用，各種各樣工業(yè)廢物的排出，使人們很需要有一套高度靈敏，技術(shù)簡單的測試系統(tǒng)來監(jiān)視環(huán)境的變化。只有真核的測試系統(tǒng)更能直接推測誘變物質(zhì)對人類或其它高等生物的遺傳危害，在這方面，微核測試是一種比較理想的方法。且有研究顯示以植物進行微核測試與以動物進行的一致率可達99%以上。目前微核測試已經(jīng)廣泛應用于輻射損傷、輻射防護、化學誘變劑、新藥試驗、染色體遺傳疾病及癌癥前期診斷等各方面 利用蠶豆根尖作為實驗材料進行微核測試，可準確的顯示各種處理誘發(fā)畸變的效果，并可用于污染程度的監(jiān)測。利用蠶豆初生根尖細胞微核（micronucleus, MN)技術(shù)監(jiān)側(cè)水環(huán)境，系國內(nèi)外的一種新的生物學測試系統(tǒng)。本檢測法的立論根據(jù)是：動物、植物和人的外周血淋巴細胞等受到致突變物處理后都有增加微核的趨勢，并且它們的定性反應一致性可達99％以上。此項技術(shù)簡便、易行、費用低，適用于河流湖泊、水庫、池塘以及各種工礦企業(yè)廢水、生活污水中所含致突變物的監(jiān)測?！緦嶒炗闷贰繉嶒灢牧纤勺糖嗥ざ梗ㄆ胀ㄐQ豆代替） 蠶豆根尖細胞的染色體大，DNA 含量多，因而對誘變物反應敏感。松滋青皮豆是華中師范大學生命科學學院遺傳學教研室從蠶豆不同品種中篩選出來的微核試驗敏感品種。本品種栽培繁殖時要注意不和其它蠶豆品種種在一起，不噴農(nóng)藥，以保持該品種較低的本底微核值。如果只需對水環(huán)境的監(jiān)測起警報系統(tǒng)作用，也可用其它當?shù)匦Q豆品種，但要注意設好對照組。種子成熟曬干后，為保證其發(fā)芽率，要貯于干燥器內(nèi)，或用牛皮紙袋裝好放人4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?．器材顯微鏡、溫箱、恒溫水浴鍋、冰箱、手掀計數(shù)器、解剖盤（或鋁制飯盒）、鑷子、解剖針、載玻片、蓋玻片、試劑瓶、燒杯等顯微壓片實驗用具。3．藥品1）5 mol/L HC1。2）卡諾氏液：無水乙醇（或95％乙醉)3 份加冰醋酸1 份配成。固定根尖時隨用隨配。3）席夫氏（Schiff）試劑：稱0. 5 g 堿性品紅（Fuchsin Basic)加蒸餾水100 ml 置三角燒瓶中煮沸5 min，并不斷攪拌使之溶解。冷卻到58℃時過濾于深棕色試劑瓶中，待濾液冷至25 ℃時再加人10 ml 1 mol/lHCl 和1 g 偏重亞硫酸鈉或偏重亞硫酸鉀（Na2S2O5 或K2S2O5）充分振蕩使其溶解。塞緊瓶口，用黑紙包好，置于暗處至少24 h，檢查染色液如果是透明無色即可使用。此染色液在4℃冰箱中可保存6個月左右，如出現(xiàn)沉淀就不能再用。4）SO2 洗滌液貯存液：10% Na2S2O5（或K2S2O5)溶液，1 mol/L HCI使用液：取上述10% Na2S2O5（或K2S2O5)溶液 5 m，加1mol/l HCl 5 ml，再加蒸餾水100 ml 配成，現(xiàn)用現(xiàn)配。【方法步驟】蠶豆浸種催芽1) 浸種 將當年或前一年的蠶豆種子按需要量放人盛有自來水（或蒸餾水）的燒杯中，置25 ℃的溫箱內(nèi)浸泡24 h－36 h，此期間至少換水2 次，換用的水最好事先置于 25 ℃溫箱中預溫。（如室溫超過25℃，即可在室溫下進行浸種催芽。）2) 催芽 待種子吸脹后，用紗布松松包裹置解剖盤（或鋁盒）內(nèi)，保持濕度，在25 ℃的溫箱中催芽12 h－24 h，待種子初生根露出2 mm－3 mm 時，選取發(fā)芽良好的種子，放人鋪有薄層濕脫脂棉的解剖盤（或鋁盒）內(nèi)，仍置人25 ℃的溫箱中繼續(xù)催芽，注意保持濕度。再經(jīng)36 h－48 h，種子大部分初生根長至1. 5 cm－2 cm，根毛發(fā)育良好，這時就可用來作為監(jiān)側(cè)水源樣品或檢測藥物溶液誘變效應之用。被監(jiān)測液處理根尖1) 每一處理選取6 粒－8 粒初生根尖生長良好、根長較一致的種子，放人盛有被測液的培養(yǎng)皿中，讓被測液浸泡住根尖即可。用自來水（或蒸餾水）處理作對照，方法相同。2) 處理時間4 h－6 h，視實驗要求和被測液的濃度等情況而定。根尖細胞修復培養(yǎng)1) 將處理后的種子，用自來水（或蒸餾水）浸洗3 次，每次2 min－3 min。2) 洗凈后的種子再放人新鋪好的濕脫脂棉的解剖盤（或鋁盒）內(nèi)，按前述培養(yǎng)條件使根尖細胞修復22 h－24 h，亦可在培養(yǎng)皿中用自來水浸住根尖修復培養(yǎng)。固定根尖細胞1) 將修復培養(yǎng)后的豆子，從根尖頂端切下1 cm 長的幼根放人空青霉素瓶中，加卡諾氏固定液固定24 h－48 h。2) 固定后的幼根如不及時制片，可換人70％的乙醇中，置4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。孚爾根（Feulgen）染色1）固定好的幼根，在青霉素瓶中用蒸餾水浸洗2 次，每次5 min。2) 吸凈蒸餾水，再加人5 mol/L HCl 將幼根泡住，連瓶放人28℃水浴鍋中水解幼根25 min 左右，視根軟化的程度可適當增減時間，當幼根被軟化即可。3) 用蒸餾水浸洗幼根2 次，每次5min。4) 在暗室或遮光的條件下加席夫（Schiff）試劑，每瓶用量以淹住幼根液面高出2 mm 為好。在遮光條件下染色過夜（約12h）。5) 除去染液，用SO2 洗滌液浸洗幼根2 次，每次5 min,6）用蒸餾水浸洗一次，5 min。7) 將幼根放人新?lián)Q的蒸餾水中，置4 ℃ 冰箱內(nèi)保存，可供隨時制片之用。制片1) 將幼根放在擦凈的載玻片上，用解剖針截下1 mm 左右的根尖。2) 滴上少許蒸餾水或45％的醋酸溶液，用解剖針將根尖搗碎。3) 加蓋一清潔的蓋玻片，注意不要有氣泡。4）在蓋玻片上加一小塊濾紙，用左手食指壓住蓋玻片一角，右手用鉛筆上的橡皮頭一端敲打壓片，切勿讓蓋玻片與載玻片之間滑動。鏡檢及微核識別標準將制片先置低倍顯微鏡下找到分生組織區(qū)細胞分散均勻、膨大、分裂相較多的部位，再轉(zhuǎn)到高倍鏡（物鏡40X）下進行觀察。附：微核識別的標準：1) 凡是主核大小的1/3 以下，并與主核分離的小核； 2）小核著色與主核相當或稍淺；3) 小核形態(tài)可為圓形、橢圓形、不規(guī)則形等。凡符合以上三條的小核就是微核。每一處理觀察3 個－5 個根尖，每個根尖計數(shù)1 000 個細胞中的微核數(shù)?！緦嶒灲Y(jié)果】將微核觀察記載表上所得數(shù)據(jù)，按如下步驟進行統(tǒng)計學處理。各測試樣品（包括對照組）微核千分率（MN ‰）的計算為：某測試樣點（或?qū)φ眨┯^察到的MN 數(shù)MN‰＝——————————————————— X 1 000‰某測試樣點（或?qū)φ眨┯^察的細胞數(shù) 如果被監(jiān)測的樣品不多，可直接用各樣品MN 千分率平均值與對照比較（t 檢驗），從差異的顯著性判斷水質(zhì)污染與否。 如被監(jiān)測的樣品較多，可先用方差分析（F 檢驗）看各采樣點（或各樣品）所出現(xiàn)的MN 千分率平均值和對照組差異的顯著性。如差異顯著，還可進行各采樣點微核差異顯著性的多重比較，看被檢測樣品的MN 千分率平均值差異顯著性的分組情況，以歸納劃分這些不同采樣點不同級別的污染程度。4．如采用已篩選出的、專門隔離栽培、無污染的松滋青皮豆作實驗材料，并按規(guī)范標準實驗條件（其對照本底MN‰為10‰以下），其監(jiān)測樣品污染程度的劃分，可不用上述（2)、（3)兩種統(tǒng)計處理方法，而直接采用如下標準：1) MN ‰ 在10 ‰ 以下為基本無污染；10 ‰－18 ‰ 區(qū)間為輕度污染；18‰－30‰?yún)^(qū)間為中度污染；30‰ 以上為嚴重污染。2) “污染指數(shù)（pollution index）”判別此方法可避免因?qū)嶒灄l件等因素帶來的MN‰本底的波動，故較宜適用。樣品實測MN‰平均值污染指數(shù)（PI）＝——————————————— 標準水（對照組）MN‰平均值附：蠶豆根尖微核檢測記錄表試驗號 鏡檢日期 鏡檢者【實驗報告】以小組為單位整理實驗數(shù)據(jù)，撰寫實驗報告；每人寫一份實驗心得體會。