【正文】 生長發(fā)育期的特異性。次生產(chǎn)物在植物中的合成與分解過程稱為次生代謝植物次生產(chǎn)物種類繁多（據(jù)保守估計已超過2萬種），根據(jù)分子結(jié)構(gòu)不同大致分為：酚類化合物黃酮類、單酚類、醌 類（苯醌、萘醌、蒽醌）萜類化合物三萜皂甙、甾體皂甙、單萜、倍半萜、二萜含氮化合物生物堿（真生物堿、偽生物堿、原生物堿）、食品、輕化工業(yè)等領域具有重要意義。保護生態(tài)環(huán)境、提高生產(chǎn)效率、發(fā)展新型生物技術產(chǎn)業(yè)：20世紀40年代后期。20世紀80年代以來，細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)有用的物質(zhì)，如藥物、食品、調(diào)料、香精、顏料等再生資源。一）人工栽培：采用種子繁殖、扦插等無性繁殖方法快速、大面積人工繁育紅豆杉幼苗尋找紅豆衫的替代物：從紅豆杉非樹皮部位提??；產(chǎn)紫杉醇的非紅豆杉植物優(yōu)點：生長周期縮短、簡便、直接缺點：紫杉醇含量低、生長緩慢； 提取工藝復雜二）化學合成全合成 1994年獲得成功 現(xiàn)有六種途徑缺點：合成過程煩瑣復雜，幾十步 費用高，化學試劑昂貴 總收率太低（2%）半合成以10DABⅢ和Baccatin Ⅲ作為半合成原料獲得紫杉醇，新方法用10DAT優(yōu)點：原料枝葉含量豐富、 提取相對容易，充分利用再生資源； 產(chǎn)率高； 最具實用價值可以工業(yè)化生產(chǎn)； 獲取紫杉醇構(gòu)效關系信息，進行結(jié)構(gòu)改造缺點：合成過程相對復雜（11步化學轉(zhuǎn)化和7步分離）三）生物方法組織和細胞培養(yǎng)微生物發(fā)酵優(yōu)點：擺脫自然因素，可長期穩(wěn)定生長； 適應市場、方便調(diào)節(jié)；成分簡單，有利于分離純化；成本低、生長周期短；為半合成提供原料；有望工業(yè)化生產(chǎn)缺點：產(chǎn)量低、不穩(wěn)定； 工業(yè)化放大研究生物合成研究階段：紅豆杉生物合成途徑基本明確；10種相關酶基因被克隆表達；利用基因工程手段改造紅豆杉提高紫杉醇產(chǎn)量、分子生物學與組織培養(yǎng)的聯(lián)系:植物為人類社會生存和發(fā)展提供了豐富的食物和藥品來源。人們已知的3萬多種天然產(chǎn)物中有80%來源于植物。就藥物而言，全美藥方中四分之一的藥品來源于植物次生代謝產(chǎn)物。Kossel 明確提出了植物次生代謝(secondary metabolism）的概念，認為次生代謝是植物體利用某些初生代謝產(chǎn)物為“原料”，在一系列酶的催化下，形成一些特殊的化學物質(zhì)有別于初生代謝的一類特殊而復雜的代謝過程。植物次生代謝產(chǎn)物種類 簡單酚類 酪醇 酚類化合物 黃酮類 花青素 醌類 紫草寧 低等萜類 青蒿素 萜類化合物 高等萜類 人參皂甙8. 生物堿 莨菪堿 含氮有機化合物 胺類 AA類似物 生氰苷 苦杏仁苷 多炔類 其 它 有機酸 技術路線：基因分離→尿苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因→生物信息學分析 ↓ →基因及表達特性分析 構(gòu)建植物高效表達載體→轉(zhuǎn)化回高山紅景天→功能分析技術方案：高山紅景天UDP葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因（UGT1）的分離及特性分析UGT1轉(zhuǎn)化高山紅景天及基因功能分析 高山紅景天抗性選擇標記潮霉素（Hyg）適宜濃度的確定。 潮霉素濃度為5mg/L時，外植體生長減慢，%；潮霉素濃度為10mg/L時，%；潮霉素濃度為15mg/L時，葉片全部死亡。UGT1轉(zhuǎn)基因抗性愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化及篩選→UGT1轉(zhuǎn)基因高山紅景天植株的獲得→ 高山紅景天轉(zhuǎn)基因材料分子鑒定→高山紅景天轉(zhuǎn)基因材料分子鑒定及轉(zhuǎn)基因高山紅景天愈傷組織紅景天甙含量的HPLC測定、性質(zhì)及用途:)細胞破碎； 2)提?。?)沉淀分離；4)層析分離5)萃取分離；6)結(jié)晶；7）濃縮與干燥 第四節(jié) 植物細胞的規(guī)模培養(yǎng)一、植物細胞規(guī)?；囵B(yǎng)體系建立種細胞的選擇→種細胞系的增殖與放大→大規(guī)模培養(yǎng)體系的建立1. 種細胞的選擇外植體選擇：植物類型、組織、器官在起始細胞培養(yǎng)時選擇自然狀態(tài)下產(chǎn)生天然產(chǎn)物的器官、組織作為外植體。高產(chǎn)細胞的建立：2. 種細胞系的增殖與放大培養(yǎng)目的：獲得大量的活躍生長的細胞群體，為細胞大批量生產(chǎn)準備基礎材料。方法：液體振蕩培養(yǎng)，從幾百毫升到幾升逐級放大。植物細胞大規(guī)模培養(yǎng) 細胞大規(guī)模培養(yǎng)：成批培養(yǎng)bacth culture、連續(xù)培養(yǎng)continuous culture（開放式連續(xù)培養(yǎng)、封閉式連續(xù)培養(yǎng)）、半連續(xù)培養(yǎng)semicontinuous（各種類型的培養(yǎng)個人認為要知道的）含義：在一個培養(yǎng)體積中接種細胞和添加培養(yǎng)基后，中途不再添加培養(yǎng)基也不更換培養(yǎng)基的方式。特點：培養(yǎng)裝置和操作簡單，但在培細胞生長、產(chǎn)物積累，以及培養(yǎng)基的物理狀態(tài)常常隨時間的變化而變化，培養(yǎng)檢測十分困難。同時，成批培養(yǎng)的周期短，一個培養(yǎng)周期后，細胞和培養(yǎng)液同時取出進行目的產(chǎn)物的提取，下一個培養(yǎng)周期必須重新接種，因此增加了成本。：含義：在培養(yǎng)過程中，不斷向反應器中以一定的流量添加新鮮培養(yǎng)基，同時以相同的流量從系統(tǒng)中取出培養(yǎng)液，從而維持培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)在細胞密度、產(chǎn)物濃度以及物理狀態(tài)上的相對平衡。優(yōu)點：可以延長細胞培養(yǎng)周期，從而延長目的產(chǎn)物的積累時間，增加目的產(chǎn)物產(chǎn)量。6. 半連續(xù)培養(yǎng)含義：在完成成批培養(yǎng)的一個周期后，只從反應器中取出大部分細胞懸液，保留小部分細胞懸液作為下一培養(yǎng)周期的種細胞，然后加入新鮮培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。特點：可以節(jié)省種細胞培養(yǎng)成本，同時保留的培養(yǎng)液有利于細胞分裂啟動。但細胞同步性不是很好。7. 固定化培養(yǎng)細胞固定化培養(yǎng)是指將游離的細胞包埋在多糖或多聚化合物制備成的網(wǎng)狀支持物中，培養(yǎng)液呈流動狀態(tài)進行無菌培養(yǎng)的一門技術。固定化細胞生物反應器：包埋式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)； 附著式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)固定化細胞生物反應器優(yōu)點：1）細胞固定在支持物上，培養(yǎng)基不斷更換，可以在培養(yǎng)基中提取產(chǎn)物，免除了培養(yǎng)基中因含有過多的次生產(chǎn)物而對細胞代謝產(chǎn)生的反饋機制。 2)可以較容易地控制培養(yǎng)系統(tǒng)的理化環(huán)境，從而研究特定的代謝途徑，便于調(diào)節(jié)。 3)細胞位置的固定類似于在植物體的狀態(tài)，相互間接觸密切，形成一定的理化梯度，有利于次生產(chǎn)物的合成。 4)由于細胞固定在一定的介質(zhì)中，可以不斷提取產(chǎn)物，即可以進行連續(xù)生產(chǎn)。三、植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的技術要求：：，以得到產(chǎn)量恒定的產(chǎn)物； ，在較短的時間內(nèi)能得到較高產(chǎn)量的終產(chǎn)物； ，最好能將其釋放到培養(yǎng)基中。：1) 適用于不同培養(yǎng)對象的新型生物反應器的研制。2) 提高生物反應器內(nèi)部培養(yǎng)物生長的均勻性和空間利用率。3) 培養(yǎng)物接種、取樣、無菌化等操作技術的優(yōu)化。4) 不同培養(yǎng)體系生物反應器培養(yǎng)的動力學研究與工藝優(yōu)化控制。5) 生物反應器培養(yǎng)的放大技術。：是在培養(yǎng)體系中加入水溶性或脂溶性的有機物或者具有吸附作用的多聚化合物，使培養(yǎng)體系形成上、下兩相，細胞在水相中生長，合成的次生代謝產(chǎn)物分泌出來后轉(zhuǎn)移至有機相中。兩相培養(yǎng)技術的優(yōu)點：減少產(chǎn)物的反饋抑制作用，提高產(chǎn)物含量（促進儲存在細胞內(nèi)部的產(chǎn)物分泌）；通過有機相的不斷回收及循環(huán)使用，實現(xiàn)培養(yǎng)的連續(xù)化。建立植物細胞的兩相培養(yǎng)系統(tǒng)必需滿足以下條件：⑴添加的有機物或多聚化合物對植物細胞無毒，不會影響細胞的生長和產(chǎn)物的合成。⑵產(chǎn)物能較容易地被有機物吸附或溶解于有機相中。⑶兩相之間的分離容易。⑷有機物或多聚化合物不能吸收培養(yǎng)基中的有效成分。兩相培養(yǎng)的應用舉例——紫杉醇細胞兩相培養(yǎng)①實驗材料：采用東北紅豆杉細胞系，培養(yǎng)基采用某些成分加倍后的B5培養(yǎng)基，附加蔗糖、水解酪蛋白等成分。有機溶劑采用十六烷、油酸等對產(chǎn)物有大的分配系數(shù)的物質(zhì)。②生產(chǎn)過程與紫杉醇的含量分析：無光條件下?lián)u床培養(yǎng)。離心分離獲得細胞、胞外培養(yǎng)液、有機相溶液，用高效液相色譜進行測定。對于收獲的細胞經(jīng)凍溶、加入環(huán)已烷研磨破壁，再加入甲醇超聲處理，合并甲醇，用于測定。③結(jié)果：胞內(nèi)含量：。胞外培養(yǎng)液:。有機相中:。 人工種子的概念及意義（這個老師有磨嘰）人工種子（artificial seed）是指通過植物組織培養(yǎng)的方法獲得的具有正常發(fā)育能力的材料，如胚狀體，外面再包有特定物質(zhì)，通常是一層有機的薄膜包裝，這種與天然種子相類似的人工合成種子稱作人工種子或無性種子和人造種子。一、人工種子意義：具有繁殖速度快、結(jié)構(gòu)完整等特點；體細胞胚可以固定F1代雜種優(yōu)勢；為一些不能采用種子繁殖的園藝作物開辟了良種繁育的新途徑。二、人工種子的制作程序：體細胞胚的誘導及同步化控制；人造胚乳及人造種皮研制及包埋；人工種子的貯存及萌發(fā)。體細胞胚胎發(fā)生的同步化控制化學抑制法、低溫抑制法、機械過篩選擇法、滲透壓選擇法、應用植物胚性細胞分級儀三、人造種皮及人造胚乳研制及包埋:對人造種皮總的要求是：能保持胚狀體的活力，利于萌發(fā)和貯藏。因此，所選的材料要有韌性，耐壓，對胚狀體無毒害作用，含有胚狀體發(fā)芽生長所需的營養(yǎng)成分或植物激素，還應含有殺菌劑以防止播種后土壤微生物的侵染。:人造胚乳的主要成分為無機鹽、碳水化合物及蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)。:最佳的包埋材料是藻酸鹽、包埋方法有滴注法和裝模法四、人工種子研究歷史：； ，生產(chǎn)人工種子。 、棉花、玉米、甘藍、萵苣、苜蓿等人工種子制作獲得成功。 （863 計劃），并已取得一些重要的研究成果。五、人工種子各部分功能 體細胞胚：為了使人工種子在一定條件下萌發(fā)生長，并形成完整植株，人工種子首先應該具備一個能夠很好地發(fā)育成完整植株能力的胚，它具有胚根和胚芽的雙極性，經(jīng)原胚、球形胚、心形胚、魚雷胚和子葉形胚等不同階段發(fā)育而成。 人工胚乳：人工胚乳為體細胞胚萌發(fā)提供營養(yǎng)物質(zhì)。根據(jù)使用者的目的，可向人工胚乳內(nèi)自由添加有利于胚狀體正常萌發(fā)所需的各種營養(yǎng)成分、防病蟲物質(zhì)、植物激素等，也是人工種子優(yōu)越于天然種子之處。 人工種皮：包裹在人工種子的最外層，對人工種子起到保護作用，保護人工種子內(nèi)部的水分和營養(yǎng)不致喪失和防止外部物理沖擊，還要保證通氣。 六、人工種子種類 根據(jù)包裹體細胞胚材料的不同，可以將人工種子分為以下4種類型（Redenbaush等，1991）。 1）裸露的或休眠的繁殖體，可以直接播種，如休眠的微鱗莖和微型薯等。 2）人工種皮包裹的繁殖體。 3）水凝膠包埋的胚狀體、不定芽以及休眠的小鱗莖等繁殖體，水凝膠中可含多種養(yǎng)分和激素，促進繁殖體的生長。 4）液膠包埋的繁殖體。 七、人工種子與天然種子比較有其自身的特點： 1）可對一些自然條件下不結(jié)實的或種子很昂貴的植物進行繁殖。 2）固定雜種優(yōu)勢，使Fl雜交種可多代利用，使優(yōu)良的單株能快速繁殖成無性系品種，從而大大縮短育種年限。 3）在人工種子的包裹材料里加入各種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、菌肥、農(nóng)藥等，可人為地影響控制作物生長發(fā)育和抗性。 4)可以保存及快速繁殖脫病毒苗，克服某些植物由于長期營養(yǎng)繁殖所積累的病毒病等。 5)與試管苗相比成本低，運輸方便(體積小)，可直接播種和機械化操作。 八、人工種子的研制 體細胞胚的誘導與同步化控制方法：1. 人工種子制備包括胚狀體的誘導與同步化、人工種子的包埋、人工胚乳的制作、人工種皮的制作、人工種子貯藏等步驟內(nèi)容。 體細胞胚誘導與同步化控制 ；體細胞胚的誘導與同步化控制方法： 獲得發(fā)育正常、形態(tài)上較為一致的體細胞胚后，就要用適合的材料進行包埋。進行包埋時應做到以下幾點： （1）包埋材料必須對體細胞胚無損害和無毒性，并能保護胚和胚發(fā)芽的能力，成本低廉； （2）同時在制造、貯藏、運輸和種植過程中必須具有耐久性，一定的硬度； （3）膠囊必須含有養(yǎng)分和植物激素以及植物生長和發(fā)育所需的成分和水分，以保證體細胞胚的正常萌發(fā)；（4）人工種子適合于農(nóng)業(yè)機械化播種。： （這個貌似我沒有聽過他磨嘰，了解吧）經(jīng)研究認為藻酸鹽所形成的膠囊是目前最好的凝膠包埋材料，所采用的主要方法是滴注和裝膜兩種。1）滴注法：制備人工種子是將選擇好的體細胞胚懸浮于含2%～3%的藻酸鈉溶液中，這時離子間發(fā)生交換而形成膠囊，膠囊的直徑依賴于吸管的內(nèi)徑和吸注的速度，膠囊的大小，視體細胞胚的大小和發(fā)芽能力而定，一般采用吸管口徑為3－4 mm，可得直徑為4－5 mm的膠囊。體細胞胚包在膠囊中的位置不宜處在中央，宜偏在一邊以利萌發(fā)。至于聚合時間長短則依賴于所用試劑濃度。一般藻酸鈉的濃度控制在2％－3%，在CaCl2中停留實踐不要超過10min，以免膠囊太硬而影響發(fā)芽。形成膠囊后轉(zhuǎn)入無菌水中沖洗，最后在1/2MS培養(yǎng)基上作發(fā)芽和轉(zhuǎn)換試驗或進一步包裹人工種皮。 2）裝膜法：制備人工種子是把體細胞胚混合到一個溫度較高的膠液中，然后滴注到一個有小坑的微滴板上，隨著溫度降低變?yōu)槟z而形成膠丸。 ：美國杜邦公司生產(chǎn)的Elvax4260是一種較好的“人工種皮”材料，是由乙烯、乙酸和丙烯酸三種物質(zhì)共聚的產(chǎn)物，用它作為人工種子最外層的包裹劑，即人工種皮取得較好效果 。 ： 1）將4 g藻酸鈣膠囊置于20 mL甘油的氫氧化鈉溶液中攪拌1min； 2）在50 mL環(huán)乙烷中加入10%的Elvax4260。 3）在40℃條件下溶解5g硬脂酸，10 g鯨醋醇和25 g鯨醋取代