【正文】 生長(zhǎng)發(fā)育期的特異性。次生產(chǎn)物在植物中的合成與分解過(guò)程稱為次生代謝植物次生產(chǎn)物種類(lèi)繁多（據(jù)保守估計(jì)已超過(guò)2萬(wàn)種），根據(jù)分子結(jié)構(gòu)不同大致分為：酚類(lèi)化合物黃酮類(lèi)、單酚類(lèi)、醌 類(lèi)（苯醌、萘醌、蒽醌）萜類(lèi)化合物三萜皂甙、甾體皂甙、單萜、倍半萜、二萜含氮化合物生物堿（真生物堿、偽生物堿、原生物堿）、食品、輕化工業(yè)等領(lǐng)域具有重要意義。保護(hù)生態(tài)環(huán)境、提高生產(chǎn)效率、發(fā)展新型生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)：20世紀(jì)40年代后期。20世紀(jì)80年代以來(lái)，細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)有用的物質(zhì)，如藥物、食品、調(diào)料、香精、顏料等再生資源。一）人工栽培：采用種子繁殖、扦插等無(wú)性繁殖方法快速、大面積人工繁育紅豆杉幼苗尋找紅豆衫的替代物：從紅豆杉非樹(shù)皮部位提??；產(chǎn)紫杉醇的非紅豆杉植物優(yōu)點(diǎn)：生長(zhǎng)周期縮短、簡(jiǎn)便、直接缺點(diǎn)：紫杉醇含量低、生長(zhǎng)緩慢； 提取工藝復(fù)雜二）化學(xué)合成全合成 1994年獲得成功 現(xiàn)有六種途徑缺點(diǎn)：合成過(guò)程煩瑣復(fù)雜，幾十步 費(fèi)用高，化學(xué)試劑昂貴 總收率太低（2%）半合成以10DABⅢ和Baccatin Ⅲ作為半合成原料獲得紫杉醇，新方法用10DAT優(yōu)點(diǎn)：原料枝葉含量豐富、 提取相對(duì)容易，充分利用再生資源； 產(chǎn)率高； 最具實(shí)用價(jià)值可以工業(yè)化生產(chǎn)； 獲取紫杉醇構(gòu)效關(guān)系信息，進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造缺點(diǎn)：合成過(guò)程相對(duì)復(fù)雜（11步化學(xué)轉(zhuǎn)化和7步分離）三）生物方法組織和細(xì)胞培養(yǎng)微生物發(fā)酵優(yōu)點(diǎn)：擺脫自然因素，可長(zhǎng)期穩(wěn)定生長(zhǎng)； 適應(yīng)市場(chǎng)、方便調(diào)節(jié)；成分簡(jiǎn)單，有利于分離純化；成本低、生長(zhǎng)周期短；為半合成提供原料；有望工業(yè)化生產(chǎn)缺點(diǎn)：產(chǎn)量低、不穩(wěn)定； 工業(yè)化放大研究生物合成研究階段：紅豆杉生物合成途徑基本明確；10種相關(guān)酶基因被克隆表達(dá)；利用基因工程手段改造紅豆杉提高紫杉醇產(chǎn)量、分子生物學(xué)與組織培養(yǎng)的聯(lián)系:植物為人類(lèi)社會(huì)生存和發(fā)展提供了豐富的食物和藥品來(lái)源。人們已知的3萬(wàn)多種天然產(chǎn)物中有80%來(lái)源于植物。就藥物而言，全美藥方中四分之一的藥品來(lái)源于植物次生代謝產(chǎn)物。Kossel 明確提出了植物次生代謝(secondary metabolism）的概念，認(rèn)為次生代謝是植物體利用某些初生代謝產(chǎn)物為“原料”，在一系列酶的催化下，形成一些特殊的化學(xué)物質(zhì)有別于初生代謝的一類(lèi)特殊而復(fù)雜的代謝過(guò)程。植物次生代謝產(chǎn)物種類(lèi) 簡(jiǎn)單酚類(lèi) 酪醇 酚類(lèi)化合物 黃酮類(lèi) 花青素 醌類(lèi) 紫草寧 低等萜類(lèi) 青蒿素 萜類(lèi)化合物 高等萜類(lèi) 人參皂甙8. 生物堿 莨菪堿 含氮有機(jī)化合物 胺類(lèi) AA類(lèi)似物 生氰苷 苦杏仁苷 多炔類(lèi) 其 它 有機(jī)酸 技術(shù)路線：基因分離→尿苷二磷酸葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因→生物信息學(xué)分析 ↓ →基因及表達(dá)特性分析 構(gòu)建植物高效表達(dá)載體→轉(zhuǎn)化回高山紅景天→功能分析技術(shù)方案：高山紅景天UDP葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因（UGT1）的分離及特性分析UGT1轉(zhuǎn)化高山紅景天及基因功能分析 高山紅景天抗性選擇標(biāo)記潮霉素（Hyg）適宜濃度的確定。 潮霉素濃度為5mg/L時(shí)，外植體生長(zhǎng)減慢，%；潮霉素濃度為10mg/L時(shí)，%；潮霉素濃度為15mg/L時(shí)，葉片全部死亡。UGT1轉(zhuǎn)基因抗性愈傷組織的遺傳轉(zhuǎn)化及篩選→UGT1轉(zhuǎn)基因高山紅景天植株的獲得→ 高山紅景天轉(zhuǎn)基因材料分子鑒定→高山紅景天轉(zhuǎn)基因材料分子鑒定及轉(zhuǎn)基因高山紅景天愈傷組織紅景天甙含量的HPLC測(cè)定、性質(zhì)及用途:)細(xì)胞破碎； 2)提??；3)沉淀分離；4)層析分離5)萃取分離；6)結(jié)晶；7）濃縮與干燥 第四節(jié) 植物細(xì)胞的規(guī)模培養(yǎng)一、植物細(xì)胞規(guī)模化培養(yǎng)體系建立種細(xì)胞的選擇→種細(xì)胞系的增殖與放大→大規(guī)模培養(yǎng)體系的建立1. 種細(xì)胞的選擇外植體選擇：植物類(lèi)型、組織、器官在起始細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)選擇自然狀態(tài)下產(chǎn)生天然產(chǎn)物的器官、組織作為外植體。高產(chǎn)細(xì)胞的建立：2. 種細(xì)胞系的增殖與放大培養(yǎng)目的：獲得大量的活躍生長(zhǎng)的細(xì)胞群體，為細(xì)胞大批量生產(chǎn)準(zhǔn)備基礎(chǔ)材料。方法：液體振蕩培養(yǎng)，從幾百毫升到幾升逐級(jí)放大。植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng) 細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)：成批培養(yǎng)bacth culture、連續(xù)培養(yǎng)continuous culture（開(kāi)放式連續(xù)培養(yǎng)、封閉式連續(xù)培養(yǎng)）、半連續(xù)培養(yǎng)semicontinuous（各種類(lèi)型的培養(yǎng)個(gè)人認(rèn)為要知道的）含義：在一個(gè)培養(yǎng)體積中接種細(xì)胞和添加培養(yǎng)基后，中途不再添加培養(yǎng)基也不更換培養(yǎng)基的方式。特點(diǎn)：培養(yǎng)裝置和操作簡(jiǎn)單，但在培細(xì)胞生長(zhǎng)、產(chǎn)物積累，以及培養(yǎng)基的物理狀態(tài)常常隨時(shí)間的變化而變化，培養(yǎng)檢測(cè)十分困難。同時(shí)，成批培養(yǎng)的周期短，一個(gè)培養(yǎng)周期后，細(xì)胞和培養(yǎng)液同時(shí)取出進(jìn)行目的產(chǎn)物的提取，下一個(gè)培養(yǎng)周期必須重新接種，因此增加了成本。：含義：在培養(yǎng)過(guò)程中，不斷向反應(yīng)器中以一定的流量添加新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)以相同的流量從系統(tǒng)中取出培養(yǎng)液，從而維持培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)在細(xì)胞密度、產(chǎn)物濃度以及物理狀態(tài)上的相對(duì)平衡。優(yōu)點(diǎn)：可以延長(zhǎng)細(xì)胞培養(yǎng)周期，從而延長(zhǎng)目的產(chǎn)物的積累時(shí)間，增加目的產(chǎn)物產(chǎn)量。6. 半連續(xù)培養(yǎng)含義：在完成成批培養(yǎng)的一個(gè)周期后，只從反應(yīng)器中取出大部分細(xì)胞懸液，保留小部分細(xì)胞懸液作為下一培養(yǎng)周期的種細(xì)胞，然后加入新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。特點(diǎn)：可以節(jié)省種細(xì)胞培養(yǎng)成本，同時(shí)保留的培養(yǎng)液有利于細(xì)胞分裂啟動(dòng)。但細(xì)胞同步性不是很好。7. 固定化培養(yǎng)細(xì)胞固定化培養(yǎng)是指將游離的細(xì)胞包埋在多糖或多聚化合物制備成的網(wǎng)狀支持物中，培養(yǎng)液呈流動(dòng)狀態(tài)進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)的一門(mén)技術(shù)。固定化細(xì)胞生物反應(yīng)器：包埋式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)； 附著式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)固定化細(xì)胞生物反應(yīng)器優(yōu)點(diǎn)：1）細(xì)胞固定在支持物上，培養(yǎng)基不斷更換，可以在培養(yǎng)基中提取產(chǎn)物，免除了培養(yǎng)基中因含有過(guò)多的次生產(chǎn)物而對(duì)細(xì)胞代謝產(chǎn)生的反饋機(jī)制。 2)可以較容易地控制培養(yǎng)系統(tǒng)的理化環(huán)境，從而研究特定的代謝途徑，便于調(diào)節(jié)。 3)細(xì)胞位置的固定類(lèi)似于在植物體的狀態(tài)，相互間接觸密切，形成一定的理化梯度，有利于次生產(chǎn)物的合成。 4)由于細(xì)胞固定在一定的介質(zhì)中，可以不斷提取產(chǎn)物，即可以進(jìn)行連續(xù)生產(chǎn)。三、植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的技術(shù)要求：：，以得到產(chǎn)量恒定的產(chǎn)物； ，在較短的時(shí)間內(nèi)能得到較高產(chǎn)量的終產(chǎn)物； ，最好能將其釋放到培養(yǎng)基中。：1) 適用于不同培養(yǎng)對(duì)象的新型生物反應(yīng)器的研制。2) 提高生物反應(yīng)器內(nèi)部培養(yǎng)物生長(zhǎng)的均勻性和空間利用率。3) 培養(yǎng)物接種、取樣、無(wú)菌化等操作技術(shù)的優(yōu)化。4) 不同培養(yǎng)體系生物反應(yīng)器培養(yǎng)的動(dòng)力學(xué)研究與工藝優(yōu)化控制。5) 生物反應(yīng)器培養(yǎng)的放大技術(shù)。：是在培養(yǎng)體系中加入水溶性或脂溶性的有機(jī)物或者具有吸附作用的多聚化合物，使培養(yǎng)體系形成上、下兩相，細(xì)胞在水相中生長(zhǎng)，合成的次生代謝產(chǎn)物分泌出來(lái)后轉(zhuǎn)移至有機(jī)相中。兩相培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)：減少產(chǎn)物的反饋抑制作用，提高產(chǎn)物含量（促進(jìn)儲(chǔ)存在細(xì)胞內(nèi)部的產(chǎn)物分泌）；通過(guò)有機(jī)相的不斷回收及循環(huán)使用，實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)的連續(xù)化。建立植物細(xì)胞的兩相培養(yǎng)系統(tǒng)必需滿足以下條件：⑴添加的有機(jī)物或多聚化合物對(duì)植物細(xì)胞無(wú)毒，不會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和產(chǎn)物的合成。⑵產(chǎn)物能較容易地被有機(jī)物吸附或溶解于有機(jī)相中。⑶兩相之間的分離容易。⑷有機(jī)物或多聚化合物不能吸收培養(yǎng)基中的有效成分。兩相培養(yǎng)的應(yīng)用舉例——紫杉醇細(xì)胞兩相培養(yǎng)①實(shí)驗(yàn)材料：采用東北紅豆杉細(xì)胞系，培養(yǎng)基采用某些成分加倍后的B5培養(yǎng)基，附加蔗糖、水解酪蛋白等成分。有機(jī)溶劑采用十六烷、油酸等對(duì)產(chǎn)物有大的分配系數(shù)的物質(zhì)。②生產(chǎn)過(guò)程與紫杉醇的含量分析：無(wú)光條件下?lián)u床培養(yǎng)。離心分離獲得細(xì)胞、胞外培養(yǎng)液、有機(jī)相溶液，用高效液相色譜進(jìn)行測(cè)定。對(duì)于收獲的細(xì)胞經(jīng)凍溶、加入環(huán)已烷研磨破壁，再加入甲醇超聲處理，合并甲醇，用于測(cè)定。③結(jié)果：胞內(nèi)含量：。胞外培養(yǎng)液:。有機(jī)相中:。 人工種子的概念及意義（這個(gè)老師有磨嘰）人工種子（artificial seed）是指通過(guò)植物組織培養(yǎng)的方法獲得的具有正常發(fā)育能力的材料，如胚狀體，外面再包有特定物質(zhì)，通常是一層有機(jī)的薄膜包裝，這種與天然種子相類(lèi)似的人工合成種子稱作人工種子或無(wú)性種子和人造種子。一、人工種子意義：具有繁殖速度快、結(jié)構(gòu)完整等特點(diǎn)；體細(xì)胞胚可以固定F1代雜種優(yōu)勢(shì)；為一些不能采用種子繁殖的園藝作物開(kāi)辟了良種繁育的新途徑。二、人工種子的制作程序：體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)及同步化控制；人造胚乳及人造種皮研制及包埋；人工種子的貯存及萌發(fā)。體細(xì)胞胚胎發(fā)生的同步化控制化學(xué)抑制法、低溫抑制法、機(jī)械過(guò)篩選擇法、滲透壓選擇法、應(yīng)用植物胚性細(xì)胞分級(jí)儀三、人造種皮及人造胚乳研制及包埋:對(duì)人造種皮總的要求是：能保持胚狀體的活力，利于萌發(fā)和貯藏。因此，所選的材料要有韌性，耐壓，對(duì)胚狀體無(wú)毒害作用，含有胚狀體發(fā)芽生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)成分或植物激素，還應(yīng)含有殺菌劑以防止播種后土壤微生物的侵染。:人造胚乳的主要成分為無(wú)機(jī)鹽、碳水化合物及蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。:最佳的包埋材料是藻酸鹽、包埋方法有滴注法和裝模法四、人工種子研究歷史：； ，生產(chǎn)人工種子。 、棉花、玉米、甘藍(lán)、萵苣、苜蓿等人工種子制作獲得成功。 （863 計(jì)劃），并已取得一些重要的研究成果。五、人工種子各部分功能 體細(xì)胞胚：為了使人工種子在一定條件下萌發(fā)生長(zhǎng)，并形成完整植株，人工種子首先應(yīng)該具備一個(gè)能夠很好地發(fā)育成完整植株能力的胚，它具有胚根和胚芽的雙極性，經(jīng)原胚、球形胚、心形胚、魚(yú)雷胚和子葉形胚等不同階段發(fā)育而成。 人工胚乳：人工胚乳為體細(xì)胞胚萌發(fā)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。根據(jù)使用者的目的，可向人工胚乳內(nèi)自由添加有利于胚狀體正常萌發(fā)所需的各種營(yíng)養(yǎng)成分、防病蟲(chóng)物質(zhì)、植物激素等，也是人工種子優(yōu)越于天然種子之處。 人工種皮：包裹在人工種子的最外層，對(duì)人工種子起到保護(hù)作用，保護(hù)人工種子內(nèi)部的水分和營(yíng)養(yǎng)不致喪失和防止外部物理沖擊，還要保證通氣。 六、人工種子種類(lèi) 根據(jù)包裹體細(xì)胞胚材料的不同，可以將人工種子分為以下4種類(lèi)型（Redenbaush等，1991）。 1）裸露的或休眠的繁殖體，可以直接播種，如休眠的微鱗莖和微型薯等。 2）人工種皮包裹的繁殖體。 3）水凝膠包埋的胚狀體、不定芽以及休眠的小鱗莖等繁殖體，水凝膠中可含多種養(yǎng)分和激素，促進(jìn)繁殖體的生長(zhǎng)。 4）液膠包埋的繁殖體。 七、人工種子與天然種子比較有其自身的特點(diǎn)： 1）可對(duì)一些自然條件下不結(jié)實(shí)的或種子很昂貴的植物進(jìn)行繁殖。 2）固定雜種優(yōu)勢(shì)，使Fl雜交種可多代利用，使優(yōu)良的單株能快速繁殖成無(wú)性系品種，從而大大縮短育種年限。 3）在人工種子的包裹材料里加入各種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、菌肥、農(nóng)藥等，可人為地影響控制作物生長(zhǎng)發(fā)育和抗性。 4)可以保存及快速繁殖脫病毒苗，克服某些植物由于長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)繁殖所積累的病毒病等。 5)與試管苗相比成本低，運(yùn)輸方便(體積小)，可直接播種和機(jī)械化操作。 八、人工種子的研制 體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)與同步化控制方法：1. 人工種子制備包括胚狀體的誘導(dǎo)與同步化、人工種子的包埋、人工胚乳的制作、人工種皮的制作、人工種子貯藏等步驟內(nèi)容。 體細(xì)胞胚誘導(dǎo)與同步化控制 ；體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)與同步化控制方法： 獲得發(fā)育正常、形態(tài)上較為一致的體細(xì)胞胚后，就要用適合的材料進(jìn)行包埋。進(jìn)行包埋時(shí)應(yīng)做到以下幾點(diǎn)： （1）包埋材料必須對(duì)體細(xì)胞胚無(wú)損害和無(wú)毒性，并能保護(hù)胚和胚發(fā)芽的能力，成本低廉； （2）同時(shí)在制造、貯藏、運(yùn)輸和種植過(guò)程中必須具有耐久性，一定的硬度； （3）膠囊必須含有養(yǎng)分和植物激素以及植物生長(zhǎng)和發(fā)育所需的成分和水分，以保證體細(xì)胞胚的正常萌發(fā)；（4）人工種子適合于農(nóng)業(yè)機(jī)械化播種。： （這個(gè)貌似我沒(méi)有聽(tīng)過(guò)他磨嘰，了解吧）經(jīng)研究認(rèn)為藻酸鹽所形成的膠囊是目前最好的凝膠包埋材料，所采用的主要方法是滴注和裝膜兩種。1）滴注法：制備人工種子是將選擇好的體細(xì)胞胚懸浮于含2%～3%的藻酸鈉溶液中，這時(shí)離子間發(fā)生交換而形成膠囊，膠囊的直徑依賴于吸管的內(nèi)徑和吸注的速度，膠囊的大小，視體細(xì)胞胚的大小和發(fā)芽能力而定，一般采用吸管口徑為3－4 mm，可得直徑為4－5 mm的膠囊。體細(xì)胞胚包在膠囊中的位置不宜處在中央，宜偏在一邊以利萌發(fā)。至于聚合時(shí)間長(zhǎng)短則依賴于所用試劑濃度。一般藻酸鈉的濃度控制在2％－3%，在CaCl2中停留實(shí)踐不要超過(guò)10min，以免膠囊太硬而影響發(fā)芽。形成膠囊后轉(zhuǎn)入無(wú)菌水中沖洗，最后在1/2MS培養(yǎng)基上作發(fā)芽和轉(zhuǎn)換試驗(yàn)或進(jìn)一步包裹人工種皮。 2）裝膜法：制備人工種子是把體細(xì)胞胚混合到一個(gè)溫度較高的膠液中，然后滴注到一個(gè)有小坑的微滴板上，隨著溫度降低變?yōu)槟z而形成膠丸。 ：美國(guó)杜邦公司生產(chǎn)的Elvax4260是一種較好的“人工種皮”材料，是由乙烯、乙酸和丙烯酸三種物質(zhì)共聚的產(chǎn)物，用它作為人工種子最外層的包裹劑，即人工種皮取得較好效果 。 ： 1）將4 g藻酸鈣膠囊置于20 mL甘油的氫氧化鈉溶液中攪拌1min； 2）在50 mL環(huán)乙烷中加入10%的Elvax4260。 3）在40℃條件下溶解5g硬脂酸，10 g鯨醋醇和25 g鯨醋取代