【正文】 2/3)入容器按需要量依次取母液及生長調(diào)節(jié)物質(zhì)；加入蔗糖(30g/L)溶解加瓊脂(610g/L)，煮沸，23min；定容調(diào)PH值(pH=)；分裝培養(yǎng)瓶，封口；高壓滅菌組織培養(yǎng)常見的滅菌方法：消毒:是指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用。滅菌:是指用物理或化學的方法，殺死物體表面和孔隙內(nèi)的一切微生物或生物體，即把所有生命的物質(zhì)全部殺死。常用的滅菌方法:物理方法:干熱滅菌(烘燒和灼燒)。濕熱滅菌(常壓或高壓蒸煮)。射線處理(紫外線、超聲波、微波)。過濾除菌。大量無菌水沖洗化學方法:甲醛(福爾馬林)、過氧化氫、高錳酸鉀、來蘇兒、漂白粉、次氯酸鈉、升汞(氯化汞)、酒精培養(yǎng)基的滅菌－濕熱滅菌法：培養(yǎng)基在制備后的24h內(nèi)完成滅菌工序。高壓滅菌的原理：在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸氣不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在108kPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達121℃。在此蒸氣溫度下，可以很快殺死各種細菌及其高度耐熱的芽孢。滅菌方法：將鍋內(nèi)空氣完全排除后，關(guān)閉放氣閥。當壓力表上升達108kPa時，鍋內(nèi)溫度達121℃（在此蒸氣溫度下，可以很快殺死各種細菌及其高度耐熱的芽孢），維持2030min。過濾滅(除)菌（不耐熱的物質(zhì) ）：一些生長調(diào)節(jié)劑(赤霉素、玉米素)、某些維生素是不耐熱的，常用過濾滅菌細菌過濾器方法。，可阻止細菌細胞和真菌的孢子通過。GA3空間及物體表面滅菌：(1)紫外線滅菌(2)熏蒸滅菌：熏蒸劑:甲醛和高錳酸鉀。六、組織培養(yǎng)的歷史雖然組織培養(yǎng)技術(shù)的蓬勃發(fā)展近50年。但它的整個歷史可以追溯到上世紀初。組織培養(yǎng)的發(fā)展過程大致可以分為三個階段：萌芽階段（從20世紀初至20世紀30年代中）奠基階段（從20世紀30年代末到20世紀50年代中）快速發(fā)展階段和應(yīng)用階段（從20世紀50年代到現(xiàn)代）萌芽階段： Schwann所提出的細胞學說；,直至分到單個細胞觀點和細胞全能性觀點。 3. Hannig 1904年在無機鹽和蔗糖溶液中培養(yǎng)了蘿卜和辣根菜的胚，并使這些胚在離體條件下長到成熟； 1925，1929年把由亞麻種間雜交形成的不能成活的種子胚剝出，培養(yǎng)至成熟，證明了胚培養(yǎng)在植物遠緣雜交中利用的可能性。奠基階段(Gautheret，White和Nobecourt被譽為植物組織培養(yǎng)的奠基人)：，一是認識了B族維生素對植物生長的重要意義；二是發(fā)現(xiàn)了生長素一種天然的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)；，White由番茄根建立了第一個活躍生長的無性系，使根的離體培養(yǎng)實驗首次獲得了真正的成功。用3種B族維生素，即吡哆醇、硫胺素和煙酸，取代酵母浸出液獲得成功，后被稱為White培養(yǎng)基。（1934）在山毛柳和黑楊等形成層組織的培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)只有在培養(yǎng)基中加入了B族維生素和IAA以后，山毛柳形成層組織的生長才能顯著增加。揭示了B族維生素和生長素的重要意義，1939年連續(xù)培養(yǎng)胡蘿卜根形成獲得首次成功。同年，white由煙草種間雜種的瘤組織，Nobecourt由胡蘿卜也建立了類似的連續(xù)生長的組織培養(yǎng)物。4. 40年代和50年代初期，Skoog等確定了腺嘌呤與生長素的比例控制芽和根形成的主要條件之一，利用激動素和生長素在組織培養(yǎng)中控制器官分化。，研究進展有以下6項：①1952年，Morel和 Martin首次證實，通過莖尖分生組織離體培養(yǎng)，可以由已受病毒侵染的大麗花中獲得無毒植株。 ②1953～1954年，Muir進行單細胞培養(yǎng)獲得初步成功，對分離的單細胞進行了 “看護培養(yǎng)”。實現(xiàn)Haberlandt培養(yǎng)單細胞可能性的這一設(shè)想。③1955年，Miller等由鯡魚精子DNA中分離出細胞分裂素，并把它定名為激動素（kinetin）。④1957年，Skoog和Miller提出了有關(guān)植物激素控制器官形成的概念。 ⑤1958年，Wickson和Thimann應(yīng)用外源細胞分裂素可促成在頂芽存在的情況下處于休眠狀態(tài)的腋芽的生長。⑥ 1958～1959年，Reinert和Steward分別報道，在胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)中形成了體細胞胚。這是一種不同于通過芽和根的分化而形成植株的再生方式。現(xiàn)在知道有很多物種都能形成體細胞胚。在有些植物任何部分都可以得到體細胞胚，如胡蘿卜和毛茛上。迅快發(fā)展階段:（l）原生質(zhì)體培養(yǎng)取得重大突破。(2)細胞融合技術(shù)應(yīng)運而生。(3)花藥培養(yǎng)取得顯著成績。(4)微繁技術(shù)得到廣泛應(yīng)用。(5)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用組織培養(yǎng)在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用可以有以下10個方面（1）組織培養(yǎng)是轉(zhuǎn)基因技術(shù)不可或缺的組成部分，無論是轉(zhuǎn)基因受體的提供，還是轉(zhuǎn)化細胞的篩選和再生，都需要有組織培養(yǎng)技術(shù)作為支撐。（2）在自花授粉作物雜交育種中，或在異花授粉作物自交系選育過程中，采用花藥培養(yǎng)技術(shù)不但可縮短雜合體純合化所需的時間，而且還可以節(jié)省土地面積。（3） 在某些雌雄異株植物(如石刁柏)中，若把花藥培養(yǎng)技術(shù)包括到制種程序中去，在后代就有可能得到均勻一致的單性群體，提高經(jīng)濟效益。（4）在遠緣雜交中，通過離體授粉或原生質(zhì)體融合有可能克服受精前障礙，在通過幼齡合子胚培養(yǎng)可以克服受精后障礙，通過體細胞融合還有可能制造出細胞質(zhì)雜種。（5）對于無藥可治的病毒病，可通過莖尖培養(yǎng)消除病毒，這對解決馬鈴薯種薯退化問題能發(fā)揮重要的作用，在其他很多植物中也可用以建立無毒原種。（6）通過離體誘導(dǎo)不定芽或促進腋芽生枝，可對很多重要的園藝植物和名貴花卉、樹種進行快速繁殖。（7）應(yīng)用在細胞水平上進行突變體選擇的技術(shù)，可以在一定程度上使高等植物的育種程序微生物化，從而大大提高選擇效率，節(jié)省時間和土地面積，并且不受季節(jié)的限制。（8）體細胞無性系變異是除有性雜交和理化誘變之外的第三個變異來源。（9）通過用人工種皮包被體細胞胚制造人工種子，為某些稀有和珍貴物種的繁殖提供了一種高效的手段。（10）在無性繁殖植物中，通過對莖尖分生組織等離體材料進行超低溫保存，不但可以大大節(jié)省空間，而且還可以避免病蟲害的侵襲。一、細胞全能性概述，這些基因在適宜的外界條件下按照某種特定的程序先后表達最終分化形成一個完整的植株稱為細胞全能（totipotency)細胞全能性的相對性；不是所有基因型的所有細胞在任何條件下都具有良好的反應(yīng)；：一個植物細胞所具有的產(chǎn)生完整植物個體的潛在能力。：1）在細胞周期中運轉(zhuǎn)的細胞，屬周期細胞2）暫時脫離細胞周期的細胞，它們可在適當?shù)拇碳は轮匦逻M入細胞周期，進行增殖。屬G0期細胞。3）不可逆地脫離了細胞周期，失去分裂能力，保持生理機能的細胞，為終端化細胞.，取決于它在自然部位上所處的位置和生理狀態(tài)脫分化能力：厚壁細胞退化細胞薄壁細胞形成層營養(yǎng)生長中心5. 細胞全能性的表達是通過細胞脫分化和再分化實現(xiàn)二、細胞脫分化，而是植物界普遍存在的現(xiàn)象。離體外植體細胞實現(xiàn)全能性，首先經(jīng)歷脫分化使其恢復(fù)分生狀態(tài)，然后進行再分化。脫分化是分化的逆過程。：1）以植物體細胞為材料，可以獲得二倍體植株可以開花國、結(jié)果。2）以植物性細胞如大小孢子體為材料，可以獲得單倍體或其它倍性的植株。3）以植物單細胞的原生質(zhì)體或融合的原生質(zhì)體為材料，可以獲得不同倍性的植株，甚至自然中不存在的遠緣雜種。3. 細胞脫分化與愈傷組織形成：細胞脫分化是細胞生理狀態(tài)的改變，脫分化細胞經(jīng)過連續(xù)的有絲分裂，形成愈傷組織。 脫分化 再分化切取形成層→無菌接種 → 誘導(dǎo)愈傷組織的形成 → 試管苗的形成→培養(yǎng)室→移栽：從外植體脫分化形成愈傷組織大致可分為三個時期：啟動期 （誘導(dǎo)期）、分裂期和形成期。三個時期愈傷組織的代謝狀況、結(jié)構(gòu)以及細胞的平均大小都有明顯的差別。：1）無性繁殖并大大量擴繁被培養(yǎng)的植物2）為細胞懸浮培養(yǎng)盒次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)與利用、原生質(zhì)體培養(yǎng)和細胞融合提供易于操作的起始材料3）為植物體細胞無性系變異、細胞突變體篩選創(chuàng)造適宜的體系和基礎(chǔ)4）為外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化提供便于保存和利用的操作對象5）為種質(zhì)資源的保存提供新的形式6）為離體研究植物組織和細胞分裂、分化、代謝和狀態(tài)的轉(zhuǎn)變創(chuàng)造適宜的材料和體系：外植體的類型與生理狀態(tài)：選擇細胞分化水平較低或含低分化細胞的器官或組織；選擇幼嫩、分生能力強、不含發(fā)育抑制物或其含量較低的器官或組織作為誘導(dǎo)愈傷組織的外植體。外觀一般是鮮艷的乳白或淡黃色，呈細小顆粒狀，松散易碎。培養(yǎng)基的選擇：培養(yǎng)基的類型；激素含量等其他培養(yǎng)條件：溫度（2528或2830 、光照（光照周期1216h；光照強度15002000 lx）愈傷組織的類型：顏色：奶黃色；白色有光澤；淡綠色；黃色或褐色是否具有胚性：胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織（Induction）: 誘導(dǎo)期是細胞準備分裂的時期，是愈傷組織形成起點。特點：在誘導(dǎo)期，代謝活化了，細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和RNA含量迅速增加，細胞核體積明顯增大。細胞內(nèi)的合成代謝迅速進行，但是細胞的大小仍然和外植體時一樣，沒有多大改變。受激素作用后，分裂前細胞的主要變化有:一、呼吸作用加強，消耗氧氣的量明顯增加。二、多聚核糖體的不斷增加，到有絲分裂前RNA的含量增加300﹪；三、蛋白質(zhì)合成加快，分裂前細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的總量增加200﹪；四、各種與分裂有關(guān)的酶活性大加強。（Cell division）：外植體中已分化的活細胞在外源激素的作用下，外植體外層細胞出現(xiàn)了分裂，由于外層細胞的迅速分裂使得這些細胞的體積縮小，逐漸回復(fù)到分生組織狀態(tài)，因此也稱為回復(fù)變化。在回復(fù)變化時，細胞通過脫分化的啟動期而進入分裂，并開始形成愈傷組織。特征：是外層細胞進行分裂，而中間的細胞不分裂。另外細胞數(shù)目增加，體積變小；細胞核和核仁增到最大，RNA含量升高等。（Differentiation）特點：外植體細胞經(jīng)過誘導(dǎo)期和分裂期形成了無序結(jié)構(gòu)的愈傷組織。進入形成期后，表層細胞分裂逐漸停止，內(nèi)部深處細胞開始分裂，組織內(nèi)部形成瘤狀的擬分生組織。形成愈傷組織形成中心或者進一步分化成為維管組織。愈傷組織的特征：細胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏散；缺少有組織的結(jié)構(gòu)；顏色淺而透明。愈傷組織狀態(tài)（優(yōu)良的愈傷組織）：；，以便建立優(yōu)良的懸浮系或原生質(zhì)體；3. 高度的胚性或再分化能力；4. 可以長期繼代保存。:。:多酚氧化酶是植物體內(nèi)普遍存在的一類末端氧化酶，它催化酚類化合物形成醌和水，醌再經(jīng)非酶促聚合形成深色物質(zhì)，對植物體材料產(chǎn)生毒害作用。褐變的影響因素：植物種類及基因型。外植體的部位及生理狀態(tài)。外植體的受傷程度。4培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件。培養(yǎng)時間過長防止褐變的方法：選擇適宜的外植體對外植體進行處理，如先進行低溫處理，再放入只含糖的瓊脂培養(yǎng)基中，使酚類物質(zhì)滲入到培養(yǎng)基中。選擇適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件添加褐變抑制劑和吸附劑。如維生素C等連續(xù)轉(zhuǎn)移。減輕酚類化合物的毒害。：在進行植物組織培養(yǎng)時，經(jīng)常會出現(xiàn)試管苗生長異常，葉等出現(xiàn)透明或半透明的水浸狀植物矮小腫脹，失綠等現(xiàn)象稱為玻璃化現(xiàn)象。原因復(fù)雜沒有定論。防止玻璃化措施：增加瓊脂濃度。提高糖的含量或加入滲透劑，降低培養(yǎng)基中滲透勢，減少植物材料可獲得的水分。降低培養(yǎng)基中細胞分裂素的含量 增加光照、控制溫度、改善通風換氣條件。 細胞再分化1. 細胞水平的再分化。組織水平的再分化。官水平的再分化（又稱器官發(fā)生）2. 影響細胞再分化因素:關(guān)鍵：維管組織的分化（生長素、蔗糖濃度、細胞分裂素和赤霉素、物理因子）。同種類植物的再生能力差異；再生條件沒有完全掌握；影響因子與脫分化因子基本一致。: 在離體的培養(yǎng)條件下，植物的組織或細胞團（愈傷組織）分化形成不定根、不定芽等器官的過程。 器官發(fā)生方式:，再分化根；，再分化芽； 器官型外植體本身存在器官原基（莖尖、根尖）器官發(fā)生的解剖學:兩種途徑 器官發(fā)生型外植體→形成愈傷組織→器官原基及器官 形成4. 影響器官分化的因素:培養(yǎng)基成分：礦質(zhì)元素 有機成分 激素組合 環(huán)境條件：光照 溫度 濕度植株材料： 品種基因型的差異 材料的生理狀況培養(yǎng)基成分:礦質(zhì)元素及其他有機成分 礦質(zhì)元素促進器官發(fā)生； 糖維持培養(yǎng)基的滲透壓 提供碳源和能源5. 植物激素的應(yīng)用規(guī)律:1）先生長素，后細胞分裂素，有利于細胞分裂，但細胞不分化。容易產(chǎn)生多倍體細胞。2）先細胞分裂素，后生長素，細胞分裂也分化。3）生長素和細胞分裂素同時處理，分化頻率提高。但兩者同時存在的用量比值可以改變形態(tài)建成方向。4)生長素/細胞分裂素：比值高時，有利于根分化； 比值低時，有利于芽分化，抑制根形成； 比值適中時，促進愈傷組織生長。激素控制器官分化的模式圖: 高生長激素（2,4D） 高細胞分裂素/生長素 低細胞分裂素/生長素外植體→脫分化 → 形成愈傷組織 → 再分化→分化成芽 → 分化成根→完整植株植物激素的應(yīng)用濃度：①離體培養(yǎng)條件下。在細胞脫分化過程中，啟動細胞分裂形成愈傷組織，以2,4D最為有效。一般規(guī)律是：細胞脫分化需要高濃度的2,4D，當胚性細胞形成轉(zhuǎn)入再分化時，則需較低的2,4D濃度。②細胞分裂素在離體培養(yǎng)條件下，既可誘導(dǎo)細胞分裂，又可調(diào)節(jié)細胞分化。：離體培養(yǎng)中培養(yǎng)基滲透壓是影響植物細胞脫分化、再分化的重要因素；培養(yǎng)基滲透壓是由培養(yǎng)基中各種物質(zhì)的總濃度決定的；培養(yǎng)細胞是通過細胞滲透來吸取營養(yǎng)的，當培養(yǎng)材料和培養(yǎng)基之間處于等滲時，或培養(yǎng)材料的滲透壓略低于培養(yǎng)基滲透壓時，培養(yǎng)材料才可能汲取養(yǎng)分和水分。滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)及其應(yīng)用：糖對滲透壓起決定作用，其次甘露醇、鹽類也可影響滲透壓。①不同植物類細胞脫分化和再分化所需糖濃度不同，多數(shù)植物種適宜糖濃度為26%；②培養(yǎng)目的不同要求糖濃度不同：誘導(dǎo)器官脫分化形成愈傷組織為3%6%，愈傷組織芽分化為3