【正文】 一、組織培養(yǎng)的概念植物組織培養(yǎng)：是指在無菌和人工控制的條件下，利用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，對離體的植物器官（如根、莖、葉、花、果實、種子、胚、花藥、子房等）、組織（如形成層、皮層、胚乳等）、細(xì)胞（如體細(xì)胞、生殖細(xì)胞花粉等）、原生質(zhì)、幼小的植株進(jìn)行培養(yǎng)，使其再生細(xì)胞或完整的植株的技術(shù)。由于培養(yǎng)的植物材料已經(jīng)脫離的母體，也稱植物離體培養(yǎng)。無菌（asepsis ) ：使培養(yǎng)器皿、器械、培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料等處于無真菌、細(xì)菌、病毒等微生物的狀態(tài)，以保證植物材料在培養(yǎng)皿中正常生長和發(fā)育。人工控制的環(huán)境：光照(10001500lx)、溫度、濕度(7080﹪)、氣體(O2)等。外植體(explant) ：由活植物體上切取下來以進(jìn)行培養(yǎng)的那部分組織或器官。離體培養(yǎng)的材料，包括：器官、組織、細(xì)胞、原生質(zhì)體。 愈傷組織：原義植物在受傷之后在傷口表面形成的一團薄壁組織；在組織培養(yǎng)中指在人工培養(yǎng)基上由外植體長出來的一團無序生長的薄壁細(xì)胞。 組織培養(yǎng)分為五種類型：1）愈傷組織培養(yǎng)2）細(xì)胞培養(yǎng)3）器官培養(yǎng)（胚、花藥、子房、根、莖、葉）4）莖尖分生組織培養(yǎng)（脫毒）5）原生質(zhì)體培養(yǎng)培養(yǎng)基（culture medium ) ：是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)，為培養(yǎng)物提供生長發(fā)育及分化的營養(yǎng)物質(zhì)及支持。培養(yǎng)基的營養(yǎng)組成：1）無機營養(yǎng)大量元素：氮、磷、鉀、硫、鈣、鎂；2）無機營養(yǎng)微量元素：鐵、硼、錳、銅、鋅、鉬、氯3）有機營養(yǎng)：維生素、肌醇、氨基酸等4）植物生長調(diào)節(jié)劑：生長素類（2，4D、NAA、 IAA、 IBA) 細(xì)胞分裂素類(KT BA ZT ) 其他類（GA ABA)5） 附加物: 瓊脂、活性碳、一些天然復(fù)合物 氮是細(xì)胞中核酸的組成部分，也是生物體許多酶的成分，氮被植物吸收后轉(zhuǎn)化為氨基酸再生成蛋白質(zhì)被植物利用。氮還是葉綠素、維生素和植物激素的組成分。主要以銨態(tài)氮和銷態(tài)氮形式被利用。 磷參與植物生命中核酸及蛋白質(zhì)全成、光合作用、呼吸作用及能量的貯存、轉(zhuǎn)化、釋放等重要的生理生化過程，提高抗逆性，促進(jìn)早熟。1 鉀是許多酶的活化劑。組織培養(yǎng)中鉀能促進(jìn)器官和不定胚分化促進(jìn)葉綠體ATP的合成，增強植物光合作用和產(chǎn)物的運輸，調(diào)解植物細(xì)胞的水勢，調(diào)解氣孔運動，提高抗逆性。1 鈣、鎂、硫參與細(xì)胞壁的構(gòu)成影響光合作用，促進(jìn)代謝等生理活動二、組織培養(yǎng)的生理依據(jù)細(xì)胞全能性學(xué)說：植物體的每一個細(xì)胞都含有一個完整個體的全套基因，這些基因在適宜的外界條件下按照某種特定的程序先后表達(dá)，最終分化形成一個完整的植株，稱為細(xì)胞全能性（totipotency)全能性只是一種可能性。要把這種可能性變?yōu)楝F(xiàn)實性必須滿足兩個條件：1）要把這些細(xì)胞從植物體其余部分的抑制性影響下解脫出來，也就是說必須使部分細(xì)胞處于離體的條件下。2)要給予它們適當(dāng)?shù)拇碳?，即給予它們一定的營養(yǎng)物質(zhì)，并使它們受到一定的激素的作用。一個單細(xì)胞再生完整植株的過程A：離體單細(xì)胞
BE：單細(xì)胞增殖成
愈傷組織
F：將愈傷組織在培
養(yǎng)基上繼代
G．促進(jìn)愈傷組織分
化和增殖
H．誘導(dǎo)莖芽生根
I．再生植株移栽 全能性體現(xiàn)的兩個過程：一個已分化的細(xì)胞要表現(xiàn)它的全能性，必須經(jīng)歷兩個過程，即首先要經(jīng)歷脫分化過程，然后再經(jīng)歷再分化過程。再分化的過程有兩種方式： 1）器官發(fā)生方式 2）胚胎發(fā)生方式 胚狀體再分化植物組織培養(yǎng)過程：植物體愈傷組織脫分化根、芽離體、消毒的植物器官、組織或細(xì)胞 脫分化：一個成熟細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚鸂顟B(tài)并形成未分化的愈傷組織的現(xiàn)象。再分化：一個成熟的植物細(xì)胞經(jīng)歷了脫分化之后，經(jīng)過培養(yǎng)還能形成完整的植株的過程。再生：指組織、器官、懸浮細(xì)胞和原生質(zhì)體經(jīng)培養(yǎng)后獲得植株的過程。繼代：植物組織培養(yǎng)過程中，外植體在培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時間以后需要轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。離體培養(yǎng)條件下，細(xì)胞全能性的表達(dá)是通過細(xì)胞脫分化和再分化實現(xiàn)的。三、組織培養(yǎng)的類型 植物組織培養(yǎng)：→培養(yǎng)材料：莖尖分生組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、愈傷組織培養(yǎng)、 細(xì)胞培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng) →培養(yǎng)方式：固體培養(yǎng) 液體培養(yǎng)：震蕩培養(yǎng)、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)、靜置培養(yǎng)、紙橋培養(yǎng)(1)愈傷組織培養(yǎng)：將外植體接種在培養(yǎng)基上，由于植物生長調(diào)節(jié)劑的存在，其細(xì)胞脫分化形成愈傷組織，然后通過再分化形成再生植株。愈傷組織是一種最常見的培養(yǎng)形式，因為除莖尖分生組織和一部分器官以外，其他的幾種培養(yǎng)形式最終也都要經(jīng)過愈傷組織才能再生植株。愈傷組織的形態(tài)發(fā)生途徑 : ①胚胎發(fā)生途徑； ②器官發(fā)生途徑(2)器官培養(yǎng)：器官培養(yǎng)是通過培養(yǎng)器官的類別來分類的。培養(yǎng)的是什么器官，就稱為什么培養(yǎng)。如根、莖、葉、花、果實、種子的培養(yǎng)。 (3)胚培養(yǎng)：胚培養(yǎng)是器官培養(yǎng)的一種。選用的外植體是成熟或未成熟的胚進(jìn)行離體無菌培養(yǎng)。其具體方法是將其取出放在液體或固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，由于胚包含在胚珠和子房里，因而進(jìn)行胚胎培養(yǎng)時，常常是將胚珠和子房放在培養(yǎng)基上培養(yǎng)。胚培養(yǎng)用途：。 。 。(4)細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)：將植物的單個細(xì)胞或細(xì)胞團分離出來，放在培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。 原生質(zhì)體培養(yǎng)：指將植物細(xì)胞的細(xì)胞壁通過物理或化學(xué)的方法去除，然后再進(jìn)行培養(yǎng)。原生質(zhì)體培養(yǎng)的最大用處是體細(xì)胞雜交。(5) 莖尖分生組織培養(yǎng)四、植物組織培養(yǎng)實驗構(gòu)建及操作技術(shù) 實驗室組成：緩沖室、準(zhǔn)備室、溫室、馴化室、培養(yǎng)室、無菌操作室輔助實驗室基本實驗室 實驗室設(shè)置實驗準(zhǔn)備,培養(yǎng)基的配制,洗滌與滅菌等準(zhǔn)備室細(xì)胞學(xué)實驗室 生化分析室離體材料的無菌操作,又稱接種室準(zhǔn)備室控制條件下的離體培養(yǎng)儀器設(shè)備和器皿用具常見儀器設(shè)備：超凈工作臺或接種箱空調(diào)除濕機或加濕器恒溫培養(yǎng)箱 高壓滅菌鍋 冰箱 天平 顯微鏡 水浴鍋 搖床與轉(zhuǎn)床1 蒸餾水發(fā)生器 1酸度計 1離心機接種器具：鑷子、剪刀、解剖刀等培養(yǎng)設(shè)備：培養(yǎng)箱、培養(yǎng)架等 細(xì)胞學(xué)鑒定設(shè)備：光學(xué)研究顯微鏡、實體顯微鏡、倒置顯微鏡 培養(yǎng)基及其配制（1） 、培養(yǎng)基的成分培養(yǎng)基組成：無機營養(yǎng)物、有機營養(yǎng)物、植物生長調(diào)節(jié)劑、碳水化合物、其它添加物 無機營養(yǎng)元素(inorganic element) ：1) 大量元素：／L的元素。 [N、P、K、Mg、S和Ca等]。2) 微量元素：／L的元素。[Fe，B，Mn，Cu，Mo，Co等] 有機化合物(organic pound) （1）碳水化合物準(zhǔn)備室：最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是較好的碳源，可支持許多組織很好的生長。麥芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在組織培養(yǎng)中也有應(yīng)用。蔗糖使用濃度在2%—3%，常用3%，但在胚培養(yǎng)時采用4%15%的高濃度，因蔗糖對胚狀體的發(fā)育起重要作用。不同糖類對生長的影響不同。從各種糖對水稻根培養(yǎng)的影響來看，以葡萄糖效果最好，果糖和蔗糖相當(dāng)，麥芽糖差一些。大規(guī)模生產(chǎn)時，可用食用的綿白糖代替。最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是較好的碳源。使用濃度在1%—5%，常用3% 作用：碳源；維持培養(yǎng)基滲透壓。 （2） 維生素(vitamin) ：作用：在細(xì)胞里主要是以各種輔酶的形式參與多種代謝活動，這類化合物在植物細(xì)胞里主要是以各種輔酶的形式參與多種代謝活動，對生長、分化等有很好的促進(jìn)作用。主要有VBl(鹽酸硫胺素)、VB6(鹽酸吡哆醇)、Vpp(煙酸)、Vc（抗壞血酸）、有時還使用生物素、葉酸、VB12等。一般用量為0．1—1．0mg／L。有時用量較高。VB1對愈傷組織的產(chǎn)生和生活力有重要作用，VB6能促進(jìn)根的生長，Vpp與植物代謝和胚的發(fā)育有一定關(guān)系。Vc有防止組織變褐的作用。 使用濃度：—／L。（3） 肌醇：又叫環(huán)己六醇，在糖類的相互轉(zhuǎn)化中起重要作用。使用濃度：一般為lOOmg／L，作用：適當(dāng)使用肌醇，能促進(jìn)愈傷組織的生長以及胚狀體和芽的形成。對組織和細(xì)胞的繁殖、分化有促進(jìn)作用，對細(xì)胞壁的形成也有作用。（4）氨基酸 (amino acide）：作用：是很好的有機氮源，可直接被細(xì)胞吸收利用。種類：最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。使用濃度：為10—200mg／L。有機附加物 （天然復(fù)合物）1)椰乳：濃度10%—20% 2)香蕉：150200ml／L 3)馬鈴薯(potato) ：150—200g／L4)水解酪蛋白：濃度100—200mg／L 5)其他：酵母提取液(YE)(%%)，主要成分為氨基酸和維生素類；麥芽提取液(%～%)植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)(hormone)（1）生長素類：作用：主要被用于誘導(dǎo)愈傷組織形成；促進(jìn)細(xì)胞脫分化；促進(jìn)細(xì)胞伸長；促進(jìn)生根。在促進(jìn)生長方面，根對生長素最敏感。在極低的濃度下，(105—108mg／L)就可促進(jìn)生長，其次是莖和芽。生長素種類：吲哚乙酸：IAA；萘乙酸：NAA；吲哚丁酸：IBA；2,4二氯苯氧乙酸2,4—D生長素作用強弱順序：2,4—DNAAIBAIAA（2） 細(xì)胞分裂素類：作用：①促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴大。②誘導(dǎo)芽分化，促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)，使莖增粗，抑制莖伸長。 ③抑制根的分化。種類：6—BA(6—芐基腺嘌呤)； Kt (kinetin 激動素)； Zt (zeatin 玉米素)細(xì)胞分裂素作用強弱順序：Zt6—BAKt激素配比模式：生長素與細(xì)胞分裂素的比例決定著發(fā)育的方向（形成愈傷組織；長根；長芽）。 高 有利于根的形成和愈傷組織的形成 生長素/細(xì)胞分裂素 適中 有利于根芽的分化 低 有利于芽的形成 （3）赤霉素（GA3赤霉酸）：作用：促進(jìn)幼芽伸長生長，促進(jìn)不定胚發(fā)育成小植株。赤霉素和生長素協(xié)同作用，對形成層的分化有影響：當(dāng)生長素／赤霉素比值高時有利于木質(zhì)部分化，比值低時有利于韌皮部分化。培養(yǎng)材料的支持物 瓊脂(agar)： 固體培養(yǎng)時最好的固化劑。用量：6—10g／L。瓊脂是一種由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何營養(yǎng)。瓊脂能溶解在熱水中，成為溶膠，冷卻至40 ℃即凝固為固體狀凝膠。瓊脂的凝固能力除與原料、廠家的加工方式有關(guān)外，還與高壓滅菌時的溫度、時間、pH值等因素有關(guān)，長時間的高溫會使凝固能力下降，過酸過堿加之高溫會使瓊脂發(fā)生水解，喪失凝固能力。時間過久，瓊脂變褐，也會逐漸喪失凝固能力。 固體培養(yǎng)基的特點（與液體培養(yǎng)基相比）:優(yōu)點:操作簡便，通氣問題易解決，便于觀察研究。缺點:培養(yǎng)物與培養(yǎng)基的接觸(即吸收)面積小，各種養(yǎng)分在瓊脂中擴散較慢，影響?zhàn)B分充分利用，同時培養(yǎng)物排出的代謝廢物，聚集在吸收表面，對組織產(chǎn)生毒害作用。 抗生物質(zhì)(antibiotic) ：種類：青霉素、鏈霉素、慶大霉素等。濃度：5—20mg/L。 作用：可防止菌類污染?；钚蕴?active carbon) ：目的：是利用其吸附能力，減少一些有毒物質(zhì)的影響；利于生根。 使用濃度：1—5g／L。它的顆粒大小決定著吸附能力：粒度越小，吸附能力越大；溫度低吸附力強，溫度高吸附力減弱，甚至不吸附。水（water)：作用：是植物原生質(zhì)體的組成成分，也是一切代謝過程的介質(zhì)和溶媒。注意：用蒸餾水，最好是重蒸餾水；以保持培養(yǎng)基成分的精確性。大規(guī)模生產(chǎn)時可用自來水。 培養(yǎng)基的PH值 (pH value).注意：經(jīng)高壓滅菌后，,固調(diào)整pH值時,；pH的大小會影響瓊脂的凝固能力，當(dāng)pH，培養(yǎng)基將會變硬，pH ，瓊脂凝固不好。四、培養(yǎng)基的種類、配方及特點培養(yǎng)基(culture medium) ：是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)。在離體培養(yǎng)條件下，不同種植物的組織對營養(yǎng)有不同的要求，甚至同一種植物不同部位的組織對營養(yǎng)的要求也不相同。因此，沒有一種培養(yǎng)基能夠適合一切類型的植物組織或器官，在建立一項新的培養(yǎng)系統(tǒng)時，首先必須找到一合適的培養(yǎng)基，培養(yǎng)才有可能成功。 （1） 培養(yǎng)基的種類 根據(jù)態(tài)相不同：固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基 根據(jù)培養(yǎng)物培養(yǎng)過程：初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基 根據(jù)作用不同：誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基 根據(jù)營養(yǎng)水平：基本培養(yǎng)基、完全培養(yǎng)基、改良培養(yǎng)基。（二）常用的培養(yǎng)基及特點MS培養(yǎng)基：它是1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細(xì)胞而設(shè)計的。是目前應(yīng)用最廣泛的培養(yǎng)基。特點：是無機鹽離子濃度較高，有高含量的N、K，硝酸鹽量大，營養(yǎng)豐富。White培養(yǎng)基：1943年由White為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計的。特點：無機鹽濃度較低，適于生根培養(yǎng)。N6培養(yǎng)基：1974年朱至清等為水稻等禾谷類作物花藥培養(yǎng)而設(shè)計的。特點：是成分較簡單，KNO3和（NH4）2SO4含量高，不含鉬。在國內(nèi)已廣泛應(yīng)用于小麥、水稻及其他植物的花粉和花藥培養(yǎng)。(4)B5培養(yǎng)基:是1968年由Galmborg等為培養(yǎng)大豆根細(xì)胞而設(shè)計的。特點：是含有較低的銨鹽，較高的硝酸鹽和鹽酸硫胺素。(5)KM—8P培養(yǎng)基:它是1974年為原生質(zhì)體培養(yǎng)而設(shè)計的。特點：是有機成分較復(fù)雜，它包括了所有的單糖和維生素。 培養(yǎng)基的配制及其滅菌：將母液按順序擺放；取適量的蒸餾水(所需培養(yǎng)基量的