【正文】 液有最小的降解，如果在相同條件下， L谷氨酰胺幾乎完全降解。 31 什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？ 酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為 PH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，（特別是雌激素）。為避免固醇類反應(yīng)，培養(yǎng)細(xì)胞，尤其是哺乳類細(xì)胞時，用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測時，不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。 升級篇 細(xì)胞培養(yǎng) 7 32 培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么？ 丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源，盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。 34二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么？ 二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。 EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前，用 EDTA清洗細(xì)胞，以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價離子。 33 目錄上說， Hank‘s 平衡鹽溶液 (HBS)要在空氣中使用，不需要 CO2培養(yǎng)箱。原因是什么？ Hank’s 平衡鹽溶液 (HBS)和 Earle‘s 平衡鹽溶液 (EBS)有什么本質(zhì)的功能差別？ HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平 ,在 Eagles ()中比在 Hanks () 中高。碳酸氫鈉需用高水平的 CO2平衡，以維持溶液的 PH值。 Eagles液在空氣水平的 CO2 中，溶液會變堿， Hanks液在 CO2培養(yǎng)箱中會變酸。如果希望在 CO2培養(yǎng)箱中保存組織，需要用Eagles液。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲存的組織，用 Hanks液就可以了。 升級篇 細(xì)胞培養(yǎng) 8 35 當(dāng)在無血清培養(yǎng)基中添加抗生素時，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的 50%。血清蛋白會結(jié)合和滅活一些抗生素。在無血清培養(yǎng)條件下，抗生素不被滅活，可能對于細(xì)胞達(dá)到毒性水平。 36 一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因?yàn)橐恍┛股睾脱逯械幕境煞衷诮鈨龊缶烷_始降解。 37 大部分添加物和試劑最多可以凍融 3次，如果次數(shù)更多都會在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，將會影響它的性能。 38 在溶解的一周內(nèi)使用貯存在 4℃ 冰箱中的液體胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在 4℃ 就可能開始降解，如果在室溫下放置超過 30分鐘，就會變得不穩(wěn)定。 細(xì)胞分離試劑（ 1） 大部分連續(xù)細(xì)胞系，強(qiáng)貼壁細(xì)胞系，許多早代細(xì)胞 HBSS或無鈣鎂 PBS ％胰蛋白酶溶解在無鈣鎂平衡鹽溶液中 細(xì)胞表面蛋白完整性重要的連續(xù)細(xì)胞系 HBSS或無鈣鎂 PBS ％胰蛋白酶溶解在 EDTA 弱貼壁表皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化成纖維細(xì)胞（要求細(xì)胞表面完整性），原代細(xì)胞 HBSS或無鈣鎂 PBS EDTA,甘油 溶解在檸檬酸鈉中 強(qiáng)貼壁早代細(xì)胞系 HBSS或無鈣鎂 PBS ％胰蛋白酶溶解在 1mM EDTA， Dispase /ml 溶解在PBS 細(xì)胞分離試劑（ 2） 上皮細(xì)胞 1mM EDTA 1mM EDTA， Dispase /ml 溶解在 PBS 強(qiáng)貼壁細(xì)胞，上皮細(xì)胞，一些腫瘤細(xì)胞 1mM EDTA ％胰蛋白酶 1mM EDTA， Dispase /ml 溶解在無鈣鎂PBS 厚培養(yǎng)物，多層富含膠原的密集培養(yǎng) 1mM EDTA ％胰蛋白酶， 200單位 /ml膠原酶， 1mM EDTA溶解在無鈣鎂平衡鹽溶液中 培養(yǎng)液 pH 值變化太快 CO2 張力不對。培養(yǎng)瓶蓋擰得太緊。 NaHCO3 緩沖系統(tǒng)緩沖力不足。培養(yǎng)液中鹽濃度不正確。細(xì)菌、酵母或真菌污染。 （ 1）按培養(yǎng)液中 NaHCO3 濃度增加或減少培養(yǎng)箱內(nèi) CO2 濃度， ％ 到 10％。（ 2）改用不依賴 CO2 培養(yǎng)液。 松開瓶蓋 1/4 圈。 加 HEPES 緩沖液至 10 到 25mM 終濃度。 在 CO2 培養(yǎng)環(huán)境中改用基于 Earle′s 鹽配制的培養(yǎng)液，在大氣培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)改用 Hanks 鹽配制的培養(yǎng)液。 丟棄培養(yǎng)物或用抗生素除菌。 培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀，但 pH值不變 用洗滌劑清洗后殘留磷酸鹽將培養(yǎng)基成分沉淀下來。冰凍保存培養(yǎng)液。 用去離子水反復(fù)沖洗玻璃器皿，然后除菌。 將培養(yǎng)液加熱到 37℃ ，搖動使其溶解如沉淀仍然存在，丟棄培養(yǎng)液。 培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀， 同時 pH 發(fā)生變化 細(xì)菌或真菌污染 丟棄培養(yǎng)物。 或用抗生素除菌。 培養(yǎng)細(xì)胞不貼壁 胰蛋白酶消化過度。支原體污染。培養(yǎng)液中無貼壁因子。 縮短胰蛋白酶消化時間或降低胰蛋白酶濃度。 分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。 懸浮細(xì)胞成簇 培養(yǎng)液中含鈣、鎂離子。支原體污染。蛋白酶過度消化使得細(xì)胞裂解釋放 DNA。 用無鈣鎂平衡鹽溶液洗滌細(xì)胞，輕輕吹吸細(xì)胞獲得單細(xì)胞懸液。 分離培養(yǎng)物，檢測支原體。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。 用 DNase I 處理細(xì)胞。 原代細(xì)胞培養(yǎng)物污染 原代培養(yǎng)組織在進(jìn)入培養(yǎng)前已污染 培養(yǎng)前用含高濃度抗生素的平衡鹽溶液反復(fù)沖洗組織。 培養(yǎng)細(xì)胞死亡 培養(yǎng)箱內(nèi)無 CO2。培養(yǎng)箱內(nèi)溫度波動太大。細(xì)胞凍存或復(fù)蘇過程中損傷。培養(yǎng)液滲透壓不正確。培養(yǎng)液種有毒代謝產(chǎn)物堆積。 檢測培養(yǎng)箱內(nèi) CO2 檢查培養(yǎng)箱內(nèi)溫度 取新的保存細(xì)胞種 檢測培養(yǎng)液滲透壓。注意：大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞能耐受滲透壓為 260 – 350 mOsm/kg。加入額外試劑如 HEPES或藥物都有可能影響培養(yǎng)液滲透壓。 換入新鮮培養(yǎng)液 培養(yǎng)細(xì)胞生長減慢 由于更換不同培養(yǎng)液或血清。培養(yǎng)液中一些細(xì)胞生長必需成分如谷氨酰胺或生長因子耗盡或缺乏或已被破壞。培養(yǎng)物中有少量細(xì)菌或真菌污染。試劑保存不當(dāng)。 比較新培養(yǎng)液與原培養(yǎng)液成分，比較新血清與舊血清支持細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)。 增加起始培養(yǎng)細(xì)胞濃度。 讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)液。 換入新鮮配制培養(yǎng)液。 補(bǔ)加谷氨酰胺或生長因子。 用無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)，如發(fā)現(xiàn)污染，丟棄培養(yǎng)物?；蛴每股爻?。 血清需保存在 5℃ 到 20℃ 。培養(yǎng)液需在 2－ 8℃ 避光保存。含血清完全培養(yǎng)液在 28℃ 保存，并在 2 周內(nèi)用完。 接種細(xì)胞起始濃度太低 細(xì)胞已老化 支原體污染 增加接種細(xì)胞起始濃度。 換用新的保種細(xì)胞。 分離培養(yǎng)物，檢測支原體。清潔支架和培養(yǎng)箱。如發(fā)現(xiàn)支原體污染，丟棄培養(yǎng)物。 血清 （ 1） 1. 保存血清最好的方法 ? 建議血清應(yīng)保存在 5℃ 至 2O℃ 。然而，若存放于 4℃ 時，請勿超過一個月。若您一次無法用完一瓶，建議您無菌分裝血清至恰當(dāng)?shù)臏缇萜鲀?nèi)，再放回冷凍。 2. 如何解凍血清才不會使產(chǎn)品質(zhì)量受損 ? 建議您將血清從冷凍箱取出后，先置于 2～ 8℃ 冰箱使之融解，然后在室溫下使之全融。但必須注意的是，融解過程中必須規(guī)則地?fù)u晃均勻。 3. 血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn)，該如何處理 ? 血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白 (形成凝血的蛋白之一 )在血清解凍后，也會存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但這些絮狀沉淀物，并不影響血清本身的質(zhì)量。若欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無菌離心管內(nèi)，以 400g稍微離心 ,上清液即可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾。我們不建議您以過濾的方法去除這些絮狀沉淀物，因?yàn)樗赡軙枞倪^濾膜。 4. 為什么要熱滅活血清 ? 加熱可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng)。激活的補(bǔ)體參與溶解細(xì)胞事件，刺激平滑肌收縮，細(xì)胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在免疫學(xué)研究，培養(yǎng) ES細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時，推薦使用熱滅活血清。 血 清（ 2） 5. 有必要做熱滅活嗎 ? 實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)過正確處理的熱滅活血清，對大多數(shù)的細(xì)胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過的血清對細(xì)胞的生長只有微小的促進(jìn)，或完全沒有任何作用，甚至通常因?yàn)楦邷靥幚碛绊懥搜宓馁|(zhì)量，而造成細(xì)胞生長速率的降低。而經(jīng)過熱處理的血清，沉淀物的形成會顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是“小黑點(diǎn)”，常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在 37℃ 環(huán)境中，又會使此沉淀物更增多，使研究者誤認(rèn)為是微生物的分裂擴(kuò)增。 6. 為什么儲存在冰箱中的胎牛血清會出現(xiàn)沉淀 ? GIBICO的胎牛血清 沒有預(yù)老化，儲存在 2－ 8℃ 時，血清中的各種蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應(yīng)該不會影響血清的質(zhì)量。推薦在－ 20℃ 儲存胎牛血清，避免反復(fù)凍融。 7. 如何避免沉淀物的產(chǎn)生 ? 解凍血清時 ， 請按照所建議的逐步解凍法 (20℃ 至 4℃ 至室溫 )， 若血清解凍時改變的溫度太大 (如 20℃ 至 37℃ )， 實(shí)驗(yàn)顯示非常容易產(chǎn)生沉淀物 。 解凍血清時，請隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。 請勿將血清置于 37℃ 太久。若在 37℃ 放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會因此受到損害，而影響血清的質(zhì)量。 血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。 若必須做血清的熱滅活，請遵守 56℃ ， 30分鐘的原則，并且隨時搖晃均勻。溫度過高，時間過久或搖晃不均勻，都會造成沉淀物的增多。