【正文】 法：用于目的產(chǎn)物合成在細胞生長發(fā)育到一定時期進行，細胞生長和產(chǎn)物合成需要不同的培養(yǎng)基的類型。先在細胞生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)大批量細胞，當細胞生長至合成產(chǎn)物的階段后，再將其轉入到產(chǎn)物合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 ? 植物細胞生物反應器培養(yǎng)存在的主要問題 （ 1）攪拌或通氣對細胞有損傷，泡沫產(chǎn)生、有益氣體散失對細胞代謝不利。 （ 2）培養(yǎng)液粘度增加，影響細胞吸收營養(yǎng)及氣體傳遞。 （ 3）反應器結構有缺陷。 （ 4）相關代謝機制不清楚。 ? 植物細胞兩相培養(yǎng)技術 ? 為了解決產(chǎn)物對合成的反饋抑制可以采用兩相培養(yǎng)技術。 兩相培養(yǎng)技術：在培養(yǎng)體系中加入水溶性或脂溶性的有機物或者具有吸附作用的多聚化合物，是培養(yǎng)體系形成上下兩相，細胞在水相上生長，合成的次生代謝物質分泌出后轉移至有機相中。 優(yōu)點： ? 減少產(chǎn)物反饋抑制 ? 提高產(chǎn)物產(chǎn)量 ? 實現(xiàn)培養(yǎng)連續(xù)性 ? 生物反應器固定化培養(yǎng) ? 固定化培養(yǎng)： 是指將游離的細胞包埋在多糖或多聚化合物制備成的網(wǎng)狀支持物中、培養(yǎng)液成流動狀態(tài)進行無菌培養(yǎng)的一門技術。 ? * 細胞固定化具有以下意義： ? （ 1）細胞生長較慢，有利于次生代謝物的積累。 ? （ 2）易控制化學環(huán)境、收獲次生代謝產(chǎn)物。 ? （ 3）細胞經(jīng)包埋后受剪切力損傷小。 ? （ 4）有利于進行連續(xù)培養(yǎng)和生物轉化。 ? 細胞固定化培養(yǎng)技術按照其支持物不同可以分為兩大類： ? 包埋式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物多采用瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽 b、聚丙烯酰胺等； ? 附著式固定化培養(yǎng)系統(tǒng)：支持物采用尼龍網(wǎng)、聚氨酯泡沫、中空纖維等材料。 固定化方法： 滴入 CaCl2使海藻酸鹽形成顆粒 ? 固定化培養(yǎng)反應器： ? ① 流化床生物反應器： 細胞包裹在膠粒、金屬或泡沫顆粒中。 優(yōu)點：細胞包埋顆粒小，傳質效率高。 缺點：剪切力或碰撞破壞細胞。 ? ② 填充床生物反應器： 細胞固定在膠粒、金屬或泡沫顆?；蜻B續(xù)多個網(wǎng)中，或位于支持物表面。細胞固定不動。 優(yōu)點：單位體積容量大。 缺點：混合效率低、傳質效率低，顆?；蛩槠鬃枞后w流動，高溫變形的固定材料易阻塞。 ? ③ 膜生物反應器 常用中空纖維和螺線式卷繞反應器。 缺點：傳質效率低、易阻塞，產(chǎn)物收獲較困難，投資大。 ? 培養(yǎng)技術的選擇 包括對反應器的選擇和對培養(yǎng)方式的選擇，就目前的技術基礎來講， 固定化培養(yǎng)是植物細胞規(guī)?；a(chǎn)較為理想的系統(tǒng)。 植物原生質體培養(yǎng) ? 原生質體概念及特點 ? 原生質體定義： 去掉細胞壁的由質膜包裹著的裸細胞。 ? 特點： 無細胞壁障礙，可以方便的進行有關遺傳操作 具全能性，能人工培育發(fā)育成完整植株。 適合進行誘導融合形成雜種細胞 ? 用途： ? 原生質體沒有細胞壁，有利于細胞融合，體細胞雜交，基因轉移和單細胞培養(yǎng)。 ? 原生質體能比較容易攝取外來的遺傳物質，作為理想的受體系統(tǒng)進行各種遺傳操作的研究， ? 原生質體的分離與純化 原生質體材料來源： ? 葉片，花瓣，果實組織，子葉等， 尤其是葉肉細胞及由各部分形成的培養(yǎng)細胞和懸浮細胞。 分離方法： 機械分離法 產(chǎn)生質壁分離 —— 釋放原生質體 酶分離法 收率高、活力強、完整性好。分離原生質體最有效。 分離原生質體的酶多是一些復合酶制劑，以其所含的主要酶的作用分為 纖維素酶類 2 半纖維素酶類 3 果膠酶類 4 崩潰酶 5 蝸牛酶 ? 。 ? 原生質體分離（以葉片為例） ? 取材消毒： ? 酶解處理時把滅菌的葉片或子葉等材料下表皮撕掉，將去表皮的一面朝下放入酶液中。對于懸浮細胞等材料，如果細胞團的大小很不均一，在酶解前最好先用尼龍網(wǎng)篩過濾一次，將原細胞團去掉，留下較均勻的小細胞團時再進行酶解。 ? 酶解： ? 兩步分離法。 用果膠酶離析植物組織，收集細胞，經(jīng)洗滌后用纖維素酶解離細胞壁，然后獲得原生質體。 ? 一步分離法。 一定量的纖維素酶和果膠酶組成混合酶液，對材料進行一次性處理。 ? 原生質體的收集純化方法 ? 離心沉淀法 ? 鎳絲網(wǎng)濾出液 置于離心管（離心 23分鐘，原生質體沉于離心管底部，殘液碎屑懸浮于上清液） 棄去上清液 再把沉淀物重新懸浮于清洗培養(yǎng)基中（反復 3次） ? 漂浮法 ? 根據(jù)原生質體來源不同，利用比重大于原生質體的高滲蔗糖溶液，離心后使原生質體漂浮其上，殘渣碎屑沉到管底。 ? 沉降法和漂浮法結合 ? 將收集的原生質體低速離心，傾去上清，將沉降得到的原生質體重新懸浮于蔗糖純化液中，離心，收集表面懸浮的原生質體。再將原生質體重新懸浮于洗滌液中，離心收集沉于底部的原生質體。重復操作 ? 原生質體鑒定與活力測定 ? 一、原生質體鑒定 ? 低滲爆破法 ：把原生質體放入低滲溶液中，顯微鏡下觀察原生質體從低滲溶液中吸水漲破的過程。 ? 熒光染色法： ? 用熒光增白劑溶液對原生質體染色，在熒光顯微鏡下觀察，綠色顯示纖維素的存在，紅光是沒纖維素的真正原生質體 ? 二、活力測定 目測法： 在顯微鏡下觀察，根據(jù)細胞形態(tài)、流動性確定原生質體活力。 如形態(tài)上完整，含有飽滿的細胞質，顏色新鮮的原生質體即為存活的。 染色識別 ? A: FDA法： FDA本身沒熒光，進入細胞后被脂酶分解為具熒光的極性物，不能透過質膜，而是留在細胞內(nèi)發(fā)光。 ? B:其他染色方法 ? FDA法 ? 原生質體培養(yǎng)方法 ? 液體淺層培養(yǎng) ? 將含有原生質體的培養(yǎng)液在培養(yǎng)皿底部鋪一薄層，封口后進行培養(yǎng)。一般直徑 3cm加 ，6cm加 23ml,510天后開始原生質體分裂 ? 優(yōu)點：操作簡單，原生質體代謝物易擴散，防止有害物質積累過多造成毒害，易于添加新鮮培養(yǎng)基和轉移培養(yǎng)物。 ? 缺點：是原生質體分布不均勻，常常發(fā)生原生質體之間的粘連現(xiàn)象而影響其進一步生長與發(fā)育。此外，難以跟蹤觀察某一個細胞的發(fā)育情況。 ? 固體平板法培養(yǎng) 原生質體（密度為 4 105/ml）與等量體積瓊脂糖培養(yǎng)基均勻混合 — 置于 6cm培養(yǎng)皿，暗培養(yǎng) — 57天原生質體開始分裂 優(yōu)點：可以跟蹤觀察單個原生質體的發(fā)育情況，易于統(tǒng)計原生質體分裂頻率。 ? 缺點：操作要求嚴格，尤其是混合的溫度掌握必須合適，溫度偏高則影響原生質體的活力，溫度偏低則瓊脂糖凝固太快，原生質體不容易混合均勻。 ? 固體雙層培養(yǎng) ? 效果最佳。 即在培養(yǎng)皿低部鋪一層瓊脂糖固體培養(yǎng)基，再將原生質體懸浮液滴于固體培養(yǎng)基表面。 ? 優(yōu)點：固體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質可以緩慢釋放到液體培養(yǎng)基中，如果在下層固體培養(yǎng)基中添加一定量的活性炭，則還可以吸附培養(yǎng)物產(chǎn)生的一些有害物質，促進原生質體的分裂和細胞團的形成。 ? 缺點：不易觀察細胞的發(fā)育過程。 ? 原生質體的發(fā)育與植株再生 ? 細胞壁再生 ? 細胞分裂與生長 ? 愈傷組織形成與分化 ? 植株再生 ? 細胞壁再生： ? 一般原生質體培養(yǎng)數(shù)小時后開始再生新的細胞壁 ,一至數(shù)天便可形成完整的細胞壁。 ? 細胞分裂與生長 ? 一般原生質體培養(yǎng) 27天后 ,開始第一次分裂 ,但開始第一次分裂的時間隨植物的種類 ,分離原生質體的材料 ,原生質體的質量 ,培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件而異 . ? 用幼苗的下胚軸和子葉、幼根、懸浮培養(yǎng)的細胞、未成熟種子的子葉等為材料分離的原生質體 ；一般比用葉肉分離的原生質體容易誘導分裂，第一次分裂出現(xiàn)的時間較快。 ? ? 大多數(shù)情況下，原生質體培養(yǎng) 2周后，形成多細胞的細胞團，大約 6周后形成直徑為 2mm的小愈傷組織。 ? ? 兩種途徑： ? 誘導愈傷組織，通過先芽后根的途徑發(fā)育成完整植株。（主要途徑） ? 誘導胚狀體：在原生質體培養(yǎng)時直接誘發(fā)胚狀體生長，發(fā)育成植株。 ? 何為細胞懸浮培養(yǎng)？怎樣做到懸浮培養(yǎng)細胞的同步化 ? 以番茄合作 908為植物材料，以葉片做外植體，簡要說明番茄葉片組織培養(yǎng)及其再生植株的過程。附：誘導愈傷組織及芽分化的培養(yǎng)基為 MS + 6 BA0. 5mg/L + IBA0. 5mg/L。生根培養(yǎng)基均為 MS + IAA0. 5 mg/L