細胞培養(yǎng)基礎知識ppt課件-資料下載頁
2025-05-03 03:43本頁面
【正文】 D值 ? MTT法簡單快速、準確，廣泛應用于 新藥篩選、細胞毒牲試驗、腫瘤放射敏感性實驗 等。 操作步驟 （ 1）單細胞懸液接種于 96孔培養(yǎng)板； 103104細胞 /孔，每孔培養(yǎng)基總量 200微升（ 96孔培養(yǎng)板每孔容積 370微升）， 37℃ 、 5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間（根據(jù)實驗目的決定培養(yǎng)時間） （ 2）加入 2毫克／毫升的 MTT液（ 50微升／孔）；繼續(xù)培養(yǎng) 3小時。 （ 3）吸出孔內培養(yǎng)液后，加入 DMSO液（ 150微升／孔），將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩 10分鐘，使結晶物溶解。 （ 4）酶標儀檢測各孔 OD值（檢測波長 570nm）。記錄結果。 細胞凍存和復蘇 ? 細胞低溫冷凍貯存是細胞室的常規(guī)工作。細胞凍存與細胞傳代保存相比可以減少入力、經費，減少污染，減少細胞生物學特性變化。 凍存和復蘇的原則：慢凍快融 ? 當細胞冷到零度以下，可以產生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質濃度升高，并在細胞內形成冰晶。 ? ? 如果緩慢冷凍，可使細胞 逐步脫水 ，細胞內不致產生大的冰晶；相反．結晶就大，大結晶會造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂。復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結晶。 慢凍程序 ? 標準程序 ： ? 當溫度在 25 ℃ 以上時， 1～ 2 ℃ /min ? 當溫度達 25 ℃ 以下時， 5～ 10 ℃ /min ? 當溫度達 100℃ 時，可迅速放入液氮中（ 196度） ? 細胞凍存器 ? 簡易程序 ： ? 將冷凍管 （ 管口要朝上 ） 放入紗布袋內 ， 紗布袋系以 線繩 ，通過線繩將 紗布袋固定于液氮罐罐口 ， 按每分鐘溫度下降 1～ 2 ℃ 的速度 ， 在 40分鐘內降至液氮表面 ， 停 30分鐘后 ， 直接投人液氮中 。 低溫保護劑的應用 ? 在細胞凍存時加入溫保護劑，能大大提高凍存效果。 ? 常用的低溫保護劑是 DMSO，它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結過程，能使細胞內水分在凍結前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。 細胞凍存方法 1. 預先配制凍存液： 20%血清培養(yǎng)基 +10% DMSO 2 .取對數(shù)生長期細胞，經胰酶消化后，加入適量凍存液 , 用吸管吹打制成細胞懸液（ 1 106 ～ 5 106細胞 /ml) 3. 加入 1ml細胞于凍存管中，密封后標記冷凍細胞名 稱和冷凍日期。 4. 1年后，存活率可達 80％ — 90％。 DMSO液用培養(yǎng)液配好，避免因臨時配制產熱而傷害細胞。 慢 細胞復蘇方法 （ l） 從液氮中取出冷凍管 ， 迅速投入 37～ 38 ℃ 水浴中 ， 使其融化 （ 1分鐘左右 ） 。 （ 2） 5分鐘內用培養(yǎng)液稀釋至原體積的 10倍以上 。 （ 3） 低速離心 10分鐘 。 （ 4） 去上清 ， 加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復蘇的細胞 。 快
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