【正文】 um rhizogenes）感染雙子葉植物后，其 Ri質(zhì)粒上的 TDNA片斷整合進(jìn)植物細(xì)胞核基因組中誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種特殊表現(xiàn)型。 ? 毛狀根可以不依賴激素快速生長(zhǎng)，根多叢生，多分枝，多根毛，無(wú)向地性。 1934年， Hildebrand 報(bào)道了發(fā)根農(nóng)桿菌感染蘋果樹產(chǎn)生發(fā)根 生物反應(yīng)器培養(yǎng)青蒿毛狀根生產(chǎn)青蒿素 ? 青蒿：為雙子葉植物藥菊科植物 ? 青蒿素： ?倍半萜內(nèi)酯類化合物 ?功效：治療瘧疾 , draught cylinder, stell mesh, outlet, , nozzle, , inlet, filter, , 11. Holes on draught cylinder, valve, storage tank, device, 15. 40W fluorescent lamp 生物反應(yīng)器培養(yǎng)青蒿毛狀根生產(chǎn)青蒿素 Growth feature of Artemisia annua adventitious shoot in the mist bioreactor (a) 0 d 。 (b) 10 d 。 10cm 30cm 生物反應(yīng)器培養(yǎng)青蒿毛狀根生產(chǎn)青蒿素 ? 實(shí)驗(yàn)材料 –青蒿毛狀根： – 由發(fā)根農(nóng)桿菌 R1601誘導(dǎo)青蒿葉片產(chǎn)生 ? 培養(yǎng)方法及條件 1. 固體培養(yǎng) –20～ 30 mm青蒿毛狀根根尖 –MS固體培養(yǎng)基 (添加 30 g/L蔗糖 ) –繼代時(shí)同為 15d 生物反應(yīng)器培養(yǎng)青蒿毛狀根生產(chǎn)青蒿素 ? 培養(yǎng)方法及條件 2. 液體振蕩培養(yǎng)（三角瓶） – 接種量：每 L培養(yǎng)液（ MS） 5 g 毛狀根培養(yǎng)物（分支多且細(xì)長(zhǎng)的毛狀根） – 120130 rpm， 25177。 1 ℃ ， 12 h／ d光照 – 液體培養(yǎng)的繼代時(shí)間為 10 d。 ? 3. 反應(yīng)器培養(yǎng) – 12 h／ d培養(yǎng)， 25177。 I℃ 。 – 霧化間隔 30 min，霧化 2min。 – 通氣量為 L／ min，通氣時(shí)間為 15 mln。 最大生物量 ，青蒿素產(chǎn)量達(dá)到，青蒿素的含量為 ％。 植物細(xì)胞培養(yǎng)作為工業(yè)化和商業(yè)化生產(chǎn)藥物條件尚不成熟 需： （ 1） 深入掌握植物細(xì)胞復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制 ， 從而在反應(yīng)器的大環(huán)境內(nèi)調(diào)控細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的微環(huán)境 ， 使其朝著有利細(xì)胞生長(zhǎng)的方向發(fā)展 。 （ 2） 把生物學(xué)知識(shí)和工程技術(shù) （ 包括生化工程 、控制工程和機(jī)械工程等 ） 領(lǐng)域的知識(shí)兩方面緊密配合 ， 提高反應(yīng)器的空間利用率及細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的自動(dòng)化程度 。 （ 3） 從生命科學(xué)和植物細(xì)胞的本質(zhì)上思考和進(jìn)行植物細(xì)胞反應(yīng)器的研究 ， 在用于植物細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器的研制工作中取得根本的突破 。 小結(jié) ? 細(xì)胞規(guī)模化培養(yǎng)有可能成為新型生化工業(yè)的重要途徑，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是細(xì)胞規(guī)模化培養(yǎng)的基礎(chǔ)。 ? 各種單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是細(xì)胞克隆的基礎(chǔ)技術(shù)，也適用于植物花粉培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)。 ? 高等生物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)體系的建立必須于生物反應(yīng)器的研制相匹配。 ? 根據(jù)目的產(chǎn)物建立包括培養(yǎng)基、種細(xì)胞、培養(yǎng)方式等在內(nèi)的一系列配套技術(shù)是商業(yè)化的前體。 思考題 1．一個(gè)好的懸浮細(xì)胞系有哪些特征？用于建立懸浮細(xì)胞系的愈傷組織有何要求？ 2．建立懸浮細(xì)胞系的關(guān)鍵技術(shù)有哪些？ 3．懸浮細(xì)胞系在繼代培養(yǎng)中其群體生長(zhǎng)規(guī)律 4．細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)有哪些培養(yǎng)系統(tǒng)？ 5．植物細(xì)胞規(guī)模培養(yǎng)與次生產(chǎn)物生產(chǎn)前景及需要研究解決的問(wèn)題。 例 1. 培養(yǎng)水母雪蓮細(xì)胞產(chǎn)生黃酮類化合物 ? 材料： – 水母雪蓮愈傷組織紅色系細(xì)胞系 ? 培養(yǎng)基： – MS培養(yǎng)基 ， 附加 ／ L 6BA、 2mg／ L NAA、30g／ L蔗糖 、 10g／ L葡萄糖 ， 。 ? 種子培養(yǎng)： – 愈傷組織在 500ml三角瓶中 （ 裝瓶量 150ml）培養(yǎng)一段時(shí)間 ， 作為生物反應(yīng)器的接種液 （ 種子 ） 。 培養(yǎng)期間采用日光燈連續(xù)照射 ， 培養(yǎng)溫度為 25℃ ， 搖床轉(zhuǎn)速 100r／ min。 細(xì)胞大量培養(yǎng) ? 反應(yīng)器 ： 2L 機(jī)械攪拌式，工作體積 。 ? 通氣 ：空氣由空氣泵通過(guò)轉(zhuǎn)子流量計(jì)經(jīng)由空氣過(guò)濾器進(jìn)入反應(yīng)器。 ? 滅菌 ：操作前反應(yīng)器在 121 ℃ 下高壓滅菌 35 min，培養(yǎng)基在 121 ℃ 單獨(dú)滅菌 18 min。 ? 接種 ：待反應(yīng)器冷卻至室溫，種子和培養(yǎng)液由頂部接口傾倒入反應(yīng)器內(nèi)。 ? 培養(yǎng)條件 ：設(shè)置好通氣速率和攪拌轉(zhuǎn)速，溫度自動(dòng)控制在（ 25177。 2） ℃ 。在反應(yīng)器外用熒光燈和白熾燈照明。 重要的影響因子及相關(guān)參數(shù) ? 1．?dāng)嚢杷俣? 不同攪拌轉(zhuǎn)速下細(xì)胞生長(zhǎng)和黃酮產(chǎn)量的比較 轉(zhuǎn)速 （ r/min） 50 65 75 85 生長(zhǎng)速率 /d 干重 （ g/L） 生物量加倍時(shí)間 (d) 黃酮產(chǎn)量 (g/L) 黃酮含量 (mg/g) 2．接種量 （以干細(xì)胞計(jì)） ? 在低密度 ()培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞增長(zhǎng)幾乎停止 ? 在 45 g /L，黃酮產(chǎn)量隨密度增大明顯增加 ? 大于 6g／ L，細(xì)胞出現(xiàn)褐化死亡，黃酮產(chǎn)量出現(xiàn)下降。 ? 反應(yīng)器內(nèi)細(xì)胞的最適接種量高于搖瓶的最適接種量（搖瓶一般為 ～ /L)。 3. 細(xì)胞生長(zhǎng)和黃酮生物合成動(dòng)態(tài)變化過(guò)程 ? 水母雪蓮在培養(yǎng)期間 ， 攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量分別維持在 75rpm和 700～ 1000 L／ min。 細(xì)胞經(jīng)過(guò) 4d的延遲期后 ， 第 4～ 9d為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 ， 12d時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到高峰 ， 最大細(xì)胞濃度 （ 以干重計(jì) ） 達(dá)到 g／ L， 隨后進(jìn)入靜止期 ， 黃酮在細(xì)胞中的積累與細(xì)胞生長(zhǎng)基本平行 ， 可見 ， 黃酮積累與細(xì)胞生長(zhǎng)正相關(guān) ，這與紫草寧的生物合成發(fā)生在細(xì)胞生長(zhǎng)的靜止期不同 （ 董教望等 ， 1993） 。 在反應(yīng)器培養(yǎng)中 ， 黃酮產(chǎn)量在培養(yǎng)的第 12 d達(dá)到最高 ，為 416 mg／ L。 4 糖利用動(dòng)態(tài)變化過(guò)程 ? 在培養(yǎng)的當(dāng)天，初始蔗糖濃度有所降低，這是因?yàn)樾〔糠殖跏颊崽墙?jīng)過(guò)高溫滅菌能分解為葡萄糖和果糖。培養(yǎng)開始后蔗糖濃度迅速下降，到第 3 d只有約 5 g／ L，第 5 d后培養(yǎng)基中已檢測(cè)不到蔗糖，葡萄糖在 3d后才得到快速利用。培養(yǎng)基中蔗糖濃度的迅速降低在許多植物中被觀測(cè)到，如白蓮草（ Thalictrm rugosum）（ Kim， 1991）。 Enaksha根據(jù)對(duì)紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)的研究認(rèn)為，細(xì)胞在其表面分泌或含有過(guò)多的轉(zhuǎn)化酶（ invertase），導(dǎo)致蔗糖分解產(chǎn)生了大量的單糖。 5 聚集體分布 ? 反應(yīng)器內(nèi)聚集體分布隨培養(yǎng)進(jìn)程而發(fā)生變化 – 12mm的聚集體含量在培養(yǎng)后期明顯增加，而 23mm的聚集體含量卻相應(yīng)減少。 ? 細(xì)胞聚集體分布集中在較小尺寸 – 通過(guò)比較 12 d時(shí)搖瓶和反應(yīng)器細(xì)胞聚集體分布發(fā)現(xiàn)，搖瓶中 12mm的聚集體含量低于反應(yīng)器，其他部分則高于反應(yīng)器。 ? 聚集體大小與黃酮合成密切相關(guān)， 23mm和34mm的聚集體中黃酮含量較其他部分高。 例 2. 植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)小 蘗 堿 1． 材料 小蘗的愈傷組織細(xì)胞 2. 培養(yǎng)基 B5， MS培養(yǎng)基 3． 培養(yǎng)過(guò)程 培養(yǎng)條件：轉(zhuǎn)速為 250r/min, 溫度 25℃ 。 培養(yǎng)一段時(shí)間細(xì)胞濃度增加后，進(jìn)行繼代培養(yǎng)。 ? 培養(yǎng)基影響 – 小蘗的愈傷組織細(xì)胞在 B5培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)要好于 MS培養(yǎng)基 。 ? 激素的影響 – 生長(zhǎng)激素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用效果順序?yàn)?,4DIAANAA – 對(duì)小蘗堿合成的影響順序則是 NAA2,4D＞ IAA – KT對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)和小蘗堿合成的作用均優(yōu)于 BA 影響因素分析 影響因素分析 ? 碳源影響 – 蔗糖對(duì)小蘗堿合成具有促進(jìn)作用 ， 最佳濃度為 3％ – 果糖和葡萄糖雖能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng) ， 但是對(duì)于小蘗堿的合成有抑制作用 ? 氮源 影響 – 提高培養(yǎng)基中 銨離子 的濃度有利于原小蘗堿型生物堿的產(chǎn)生 ? 提高銅離子的濃度也能顯著促進(jìn)小蘗堿的合成 ? 物理因子也會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和小蘗堿的合成產(chǎn)生影響 。 – 如光照會(huì)抑制小蘗堿的生成 – 較高的通氣量有助于細(xì)胞生長(zhǎng)和小蘗堿的積累 影響因素分析