動物細(xì)胞培養(yǎng)生物制藥ii-資料下載頁
2025-01-13 10:00本頁面
【正文】 37℃ 時則凝固； 有的是靠離子移變而改變物相。 （四）動物細(xì)胞培養(yǎng)的影響因素 （ 1）有毒物質(zhì)或抑制因子產(chǎn)生 氨 ：來自培養(yǎng)基 +代謝，積聚影響細(xì)胞生長。 乳酸： 來自細(xì)胞的糖代謝，抑制乳酸脫氫酶，抑制糖酵解，能量產(chǎn)生減少，抑制細(xì)胞生長。 甲基乙二醛 ：脂類、氨基酸的代謝產(chǎn)物，對細(xì)胞有潛在的損傷作用。 CO2：毒性 （ 2）營養(yǎng)成分耗盡 如 谷氨酰胺 的耗竭是最常見的凋亡原因，而且凋亡一旦發(fā)生，補(bǔ)加谷氨酰胺已不能逆轉(zhuǎn)凋亡。另外，動物細(xì)胞在 無血清、無蛋白培養(yǎng)基 中進(jìn)行培養(yǎng)時，細(xì)胞變得更為脆弱，更容易發(fā)生凋亡。 （ 3）其他物理因素 滲透壓、 pH、溫度、載體、攪拌等。 細(xì)胞凋亡會減少細(xì)胞濃度，降低目標(biāo)物質(zhì)產(chǎn)量 問題討論 ，保證高的細(xì)胞濃度？ 補(bǔ)充的營養(yǎng)成分 葡萄糖 ：葡萄糖是細(xì)胞的供能物質(zhì)和主要的 碳源物質(zhì) ，然而當(dāng) 其濃度較高是會產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物乳酸，因而需要進(jìn)行其濃度控制 ，以足夠維持細(xì)胞生長而不至于產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物的濃度為佳。 谷氨酰胺 ：谷氨酰胺是細(xì)胞的供能物質(zhì)和主要的 氮源物質(zhì) ，然而當(dāng)其 濃度較高是會產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物氨，因而也需要進(jìn)行其濃度控制 ，以足夠維持細(xì)胞生長而不至于產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物的濃度為佳。 氨基酸、維生素及其他 ：主要包括必需氨基酸、非必需氨基酸、一些特殊的氨基酸如羥脯氨酸、羧基谷氨酸和磷酸絲氨酸；此外還包括其他營養(yǎng)成分如膽堿、生長刺激因子。 灌注培養(yǎng) 亡 （ 1）可以去除氨、乳酸、甲基乙二醛等代謝物質(zhì)。 （ 2）保證營養(yǎng)供給。 產(chǎn)品 導(dǎo)入 細(xì)胞凋亡抑制基因 用基因工程方法將 bcl2基因 這種細(xì)胞凋亡抑制基因?qū)爰?xì)胞。 Bcl2基因的過量表達(dá)能抑制細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞密度和目的蛋白產(chǎn)量。 Vero細(xì)胞和狂犬病毒的培養(yǎng)工藝 DMEM培養(yǎng)基 胎牛血清 其他成分 錐形瓶逐級放大培養(yǎng) 加堿（碳酸氫鈉） 加糖（葡萄糖） 灌注培養(yǎng)液 微載體 5L種子罐培養(yǎng) 培養(yǎng)液 50L 生 物 反 應(yīng) 器 接種狂犬 病毒 出液口 收獲病毒 三 動物細(xì)胞的低溫保存 （一）非玻璃化凍存 原理：冰晶損傷和溶質(zhì)損傷，緩慢冷凍和快速復(fù)蘇以及冷凍保護(hù)劑的作用（降低細(xì)胞內(nèi)的冰點(diǎn)，提高細(xì)胞膜對水的通透性，稀釋細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，從而減少溶質(zhì)損傷） 凍存方法 （ 1）冷凍步驟：旺盛生長的細(xì)胞（凍前 24小時更換培養(yǎng)液） 制備單細(xì)胞懸浮液 將甘油或二甲亞砜以 5%的終濃度加到培養(yǎng)液中，制備凍存液 凍存液懸浮細(xì)胞 4 ℃ 放置 30~60min 凍存管于 70 ℃ 冰箱中放置 1~2d 液氮保存 （ 2）復(fù)蘇步驟：液氮 37~40 ℃ 水?。?40~60s） 影響細(xì)胞凍存的因素：凍存溫度（液氮 196 ℃ ， 干冰 79 ℃ ）、冷凍速度、融凍速度及冷凍保護(hù)劑 196℃ 液氮罐 普通冰箱 低溫冰箱 （二）玻璃化凍存 玻璃化凍存的原理： （ 1）玻璃化：指液體轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷B(tài)的固化過程 （ 2）研究核心：尋求容易實(shí)現(xiàn)玻璃化并且對細(xì)胞損害較小的溶液，并設(shè)法提高冷凍速度 玻璃化冷凍保護(hù)液： 40~60%（ W/V）高濃度 凍存方法 （ 1）冷凍步驟：制備凍存液（ Hanks平衡鹽溶液中加%DMSO,%乙酰胺 ,10%丙二醇和 10%聚乙二醇， )并冰浴 離心制備待凍存細(xì)胞 緩慢加凍存液 (3min,) 混勻 液氮保存 （ 2）復(fù)蘇過程：冰浴 5min融凍 用含 20%血清的 Hanks平衡鹽溶液稀釋凍存懸液（ 50ml稀釋液滴加 65min） 低速離心回收細(xì)胞 196℃ 液氮罐 補(bǔ)充文獻(xiàn)： 課后視頻： 下節(jié)內(nèi)容 動物細(xì)胞培養(yǎng)生物制藥的應(yīng)用 預(yù)習(xí)文獻(xiàn)資料
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