植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)-資料下載頁(yè)
2025-05-09 04:08本頁(yè)面
【正文】 液體培養(yǎng) 104~105個(gè) /ml 溫度 ： 多數(shù)為 2528 oC, 少數(shù) 16~37 oC 光照： 500 lx,18h 或 2800 lx 連續(xù)光照 多數(shù)要求 黑 暗或弱光 3. 細(xì)胞壁再生及細(xì)胞分裂： l一 3天即再生新細(xì)胞壁，表現(xiàn)為體積增加、膨大，再由圓變橢圓。可用質(zhì)壁分離法或在稍微低滲溶液中出芽現(xiàn)象證實(shí)。也可用 0. 1% ST型或 WBL型熒光增白劑染色，經(jīng)前者染色，有細(xì)胞壁者在熒光顯微鏡下呈藍(lán)色熒光。經(jīng)后者染色，有細(xì)胞壁者發(fā)射綠色熒光。 在原生質(zhì)培養(yǎng)過(guò)程中， 胞質(zhì)增加，液泡減少，葉綠體或顆粒內(nèi)含物分散于泡質(zhì)中或圍繞于細(xì)胞核周?chē)?常在 1一 2周內(nèi)發(fā)生第一次分裂。不同細(xì)胞分裂頻率不同，常在 1％ — 90％之間。 （ 4）愈傷組織形成及胚狀體形成 原生質(zhì)體再生的細(xì)胞一旦開(kāi)始分裂，就可能繼續(xù)生長(zhǎng)： A 形成細(xì)胞團(tuán)，發(fā)育成愈傷組織； B. 形成胚狀體，再產(chǎn)生植株； C. 形成愈傷組織，再形成胚狀體 。 隨著細(xì)胞分裂及細(xì)胞團(tuán)形成，已與常規(guī)細(xì)胞和組織培養(yǎng)相同，故培養(yǎng) 3— 4周需添加含一定量低滲穩(wěn)定劑的新培養(yǎng)基，以滿(mǎn)足細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)，亦利于細(xì)胞團(tuán)及小愈傷組織的生長(zhǎng)。 5. 植株再生 除少數(shù)植物通過(guò)胚狀體直接發(fā)育成完整植株外，大多經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)分化形成芽及根再生為完整植株。當(dāng)愈傷組織達(dá)到 1— 2mm時(shí)，轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)器官分化。分化培養(yǎng)基與原生質(zhì)體培養(yǎng)基差別在于： (1) 只用蔗糖為碳源，不加滲透穩(wěn)定劑； (2) 與原生質(zhì)體培養(yǎng)基相反，細(xì)胞分裂素濃度高于生長(zhǎng)素 。 (3) 在誘導(dǎo)器官分化過(guò)程中，一般采用 15001x左右的高光強(qiáng)。誘導(dǎo)器官分化的溫度與原生質(zhì)體培養(yǎng)基本相同。 無(wú)根苗轉(zhuǎn)移至誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)基上培養(yǎng)生根，其只含低濃度生長(zhǎng)素，而不含細(xì)胞分裂素，無(wú)根苗一旦生根即可發(fā)育成完整植株。 （三）原生質(zhì)體融合： 在外界因素作用下，兩個(gè)或兩個(gè)以上植物細(xì)胞合并成一個(gè)多核細(xì)胞的過(guò)程稱(chēng)為植物細(xì)胞融合，或植物體細(xì)胞雜交。 但由于植物細(xì)胞具有堅(jiān)硬的細(xì)胞壁，不能直接融合，需經(jīng)酶消化除去細(xì)胞壁釋放出原生質(zhì)體，后者生理、生化及遺傳學(xué)特性與完整細(xì)胞基本相同。在適當(dāng)條件下來(lái)源不同的植物原生質(zhì)體可產(chǎn)生融合作用，并可再生細(xì)胞壁，形成完整植株。 特點(diǎn)： (1) 可實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交，獲得種間雜種，克服有性雜交配子不親合性； (2) 可獲得含另一親本非整倍體雜種或胞質(zhì)雜種，且獲得的遺傳變異范圍極廣； (3)一次操作可實(shí)現(xiàn)兩個(gè)以上親本的融合作用 (4) 可獲得呈現(xiàn)雙親個(gè)體基因型總和的雜種； (5) 可形成有性生殖障礙植物的種間雜種； 1. 促融因素： 植物原生質(zhì)體培養(yǎng)過(guò)程，有時(shí)無(wú)需任何處理亦產(chǎn)生融合現(xiàn)象，為自發(fā)融合，但融合率極低。異源原生質(zhì)體融合需某種外力作用才能實(shí)現(xiàn)。 （ 1） NaNO3誘導(dǎo) ， NaNO3 可中和原生質(zhì)體表面負(fù)電荷，促進(jìn)原生質(zhì)體聚集，對(duì)原生質(zhì)體無(wú)損害，但融合率低； （ 2） 高 Ca2＋ 和高 pH值誘導(dǎo) ，如煙草葉肉原生質(zhì)體于 pH ， mol/LCaCl2 培養(yǎng)基中， 37 ℃ 保溫，融合率可達(dá) 25％，并可獲得雜種植株； (3) PEG誘導(dǎo) ，在高濃度 PEG溶液中，原生質(zhì)體發(fā)生聚集作用，經(jīng)稀釋后， 50％以上原生質(zhì)體發(fā)生融合作用，且對(duì)多種不同原生質(zhì)體均有效； (4) 高 Ca2+、高 pH值及 PEG結(jié)合誘導(dǎo)法 ，此為方法 (2)和 (3)相結(jié)合的改良法，高 Ca2+和高 pH值對(duì)原生質(zhì)體損傷小，但對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞原生質(zhì)體促融作用小于 PEG。 (5) 其他如葡聚糖硫酸酯、聚乙烯醇及電場(chǎng)誘導(dǎo) 等融合方法。 融合過(guò)程： 23%30% 高密度混合2X105個(gè) /ml 在培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行融合的具體操作是將兩種原生質(zhì)體高密度等體積混合，調(diào)整原生質(zhì)體密度為 2xl0‘個(gè)／毫升，混合物滴于直徑為 6cm平皿內(nèi)，每滴 ml，每皿 7— 8滴，靜置 15min，令 原生質(zhì)體貼于平皿底壁，向每滴原生質(zhì)體滴加 30％ PEG溶液，于 15 oC作用 15 min，再用高 Ca2+和高 pH溶液輕輕洗滌原生質(zhì)體，第一次用 ml，第二次用 mL，第三、四次各 用 2m1，每次間 5— 10 min 緩慢吸出上清液，再用培養(yǎng)基洗滌兩次，每次 — ，間隔 5 min, 最后加 — ml培養(yǎng)液．密封平皿后在 26 oC下進(jìn)行培養(yǎng)。 3. 影響融合的因素： PEG, 高 Ca2+ 高 pH處理時(shí)間。 4. 雜種細(xì)胞的篩選： （ 1）遺傳互補(bǔ)篩選： （ 2）抗性互補(bǔ)篩選： （ 3）利用物理特性篩選： 2021年 5月 17日
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