植物細(xì)胞培養(yǎng)及原生質(zhì)體培養(yǎng)(編輯修改稿)
2025-06-14 04:08 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 上 (Ms基本成分，附加 0． 3％酵母提取物， 0． 3％水解酪蛋白，10mg／ L KT． 0． 4mg／ L NAA及 7． 0％蔗糖 )。連續(xù)光照，空溫 25℃ 。 3周后即可分化出試管苗。如果不及時(shí)轉(zhuǎn)移，愈傷組織團(tuán)塊很快失去分化能力，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基后即停止生長(zhǎng)，變褐，死亡。 三七細(xì)胞培養(yǎng)工藝： 1. 工藝流程： 2. 工藝過(guò)程： （ 1）培養(yǎng)基 植物愈傷組織誘導(dǎo)及培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為 Ms培養(yǎng)基，煙酸 0. 5mg/l，肌醇 100 mg/l ，甘氨酸 ， pH5． 6— pH5． 8。 （ 2）三七種質(zhì)材料選擇與處理 取 3— 4年生三七植株粗根，用自來(lái)水充分洗凈．再用 70％乙醇沖洗表面后切成小塊，在 70％乙醇中浸泡 2min再轉(zhuǎn)移至 0． 1％升汞溶液中浸泡 20min然后用無(wú)菌水沖洗 4— 5次，備用。 （ 3）愈傷組織誘導(dǎo)與培養(yǎng) ：將上述無(wú)菌三七粗根小塊組織接種于含 2mg/l的 2， 4— D、 KT 及 10％椰子乳的 MS固體培養(yǎng)基中，于 25℃ 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 40天，即可形成小的愈傷組織塊，然后每隔 30天進(jìn)行一次繼代培養(yǎng)。每次繼代培養(yǎng)均取一塊愈傷組織，如此多次繼代培養(yǎng)即可獲得多個(gè)愈傷組織無(wú)性系。 （ 4）．細(xì)胞懸浮培養(yǎng) : 培養(yǎng)基為含 l mg/l 2,4D、 及 l0％椰乳的 MS培養(yǎng)基 。 l00ml三角瓶的培養(yǎng)基裝量為25ml，高壓滅菌 20min冷卻后按 12g/L干重接種愈傷組織．愈傷組織切成干重 1mg 小塊。于 25℃ 搖床中以 120轉(zhuǎn)／分鐘 振蕩培養(yǎng) 30天，即得三七懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物。 （ 5）三七細(xì)胞大量培養(yǎng)：培養(yǎng)基與懸浮細(xì)胞培養(yǎng)相同。在l0L攪拌反應(yīng)器中加入培養(yǎng)液，培養(yǎng)液充滿系數(shù)為 ，滅菌后冷卻至室溫．接種已培養(yǎng) 25— 30天的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，接種量按干細(xì)胞計(jì)為 1— 2g/L，在 25— 26℃ 下，以 60轉(zhuǎn)／分鐘攪拌速度及 0． 6vvm— o． 8vvm(vvm為每分鐘單位體積培養(yǎng)液中通入空氣的體積數(shù) )速度通氣，并維持 — ．培養(yǎng) 30天，收獲細(xì)胞。 （ 6）細(xì)胞收集及干燥： 每批細(xì)胞培養(yǎng) 30天后，離心或過(guò)濾收集細(xì)胞，用去離子水洗滌 3次，每次抽干，然后于 30一 40℃低溫下真空干燥或凍干，即得三七培養(yǎng)細(xì)胞成品。 二、原生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)： 通過(guò)一定方法除去細(xì)胞壁，而得到一個(gè)裸露的植物細(xì)胞，即為原生質(zhì)體 (Protoplast)。游離的原生質(zhì)體在一定條件下培養(yǎng)可以重新形成細(xì)胞壁，并像正常的植物細(xì)胞那樣具有全能性，經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)可以再生出完整植株。 AE, 培養(yǎng)的歐當(dāng)歸 (Levisticum officinale Koch))原生質(zhì)體分裂再生成植株的過(guò)程 FL, 培養(yǎng)過(guò)程的核變化； ， ， ， ， J. 2n=22， . AD當(dāng)歸 (Angelica sinensis(Oliv) Diels)原生質(zhì)體培養(yǎng)成再生苗 EH,紅豆草 (Onobrychis vicaefolia Scop) )原生質(zhì)體培養(yǎng)再生植株 原生質(zhì)體培養(yǎng)的目的： （ 1）利用原生質(zhì)體不具細(xì)胞壁的特性可以進(jìn)行細(xì)胞器移植和外源物的攝取 (病毒、微生物、外源遺傳物質(zhì) )，原生質(zhì)體之間可以進(jìn)行融合而產(chǎn)生雜種細(xì)胞 (即體細(xì)胞雜交）。 （ 2）是植物基因工程的理想受體，用外源遺傳物質(zhì)對(duì)植物原生質(zhì)體進(jìn)行改造和轉(zhuǎn)化，然后誘導(dǎo)分裂、分化再生出能育的完整基因工程植株。 （ 3）也是研究細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、體細(xì)胞無(wú)性系變異和植物病理學(xué)研究的有用工具。 自 1970年首次獲得原生質(zhì)體再生植株成功以來(lái)，通過(guò)原生質(zhì)體獲得再生植株的植物約有 280余種，其中有 20種為我國(guó)首先報(bào)道。 原生質(zhì)體培養(yǎng)包括原生質(zhì)體的分離、培養(yǎng)、植株再生等過(guò)程。 (一 ) 原生質(zhì)體的制備： 材料來(lái)源與預(yù)處理： （ 1）材料來(lái)源： 可以用各種組織和器官，但多應(yīng)用葉片、愈傷組織及懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。以及莖尖、根尖、子葉和胚性組織。 （ 2） 預(yù)處理： ： 1720 ℃ 酶液中靜置半小時(shí)，再于 28—34℃ 保溫，或?qū)⒉牧现糜谂c酶液中糖濃度相同的溶液中預(yù)培養(yǎng)1h左右，再浸于酶液中消化即可達(dá)到質(zhì)壁分離目的； B. 預(yù)培養(yǎng) : 將除去下表皮的葉片于誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基上培養(yǎng) 7天，再用酶消化去壁，所得原生質(zhì)體分裂頻率較高； C. 暗處理 : 將室溫下生長(zhǎng) 5— 7個(gè)星期的植物材料在黑暗中放置 30h以上，取其葉片制備的原生質(zhì)體有活力； : 將葉片于日光或燈光下照射 2— 6h令其萎蔫，利于撕除下表皮及原生質(zhì)體分離； : 夏季應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)材料其萌動(dòng)種子應(yīng)于 4℃
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