細胞培養(yǎng)技術(shù)(編輯修改稿)
2025-09-11 20:38 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 入 20ml的小瓶用剪刀把組織剪碎 加入34ml的胰蛋白酶放入培養(yǎng)箱消化組織 每隔 10分鐘用吸管把組織給反復吹散利于細胞解離出 當看到液體混濁基本沒有塊狀時，吸少許 放入顯微鏡下觀察，當發(fā)現(xiàn)細胞大部分解離時加 12ml含血清的 DMEN培養(yǎng)液終止消化 移入離心管 15002022轉(zhuǎn) /分鐘離心 6分鐘 棄掉上清液 加入培養(yǎng)液重懸細胞把細胞輕輕吹散后放入細胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。一般 56天細胞可以長滿。 圖 21 組織塊培養(yǎng) 5天的水牛 圖 22 酶消化法培養(yǎng) 5天的水牛 胎兒成纖維細胞 胎兒成纖維細胞 ? 傳代培養(yǎng) ? 當細胞鋪滿細胞培養(yǎng)瓶底部時就要及時對細胞進行傳代，否則細胞生長會受到影響。每傳代一次稱為“一代”。有限細胞系在體外一般只能傳幾十代，而轉(zhuǎn)化細胞系或細胞株則可無限地傳代下去。 ? 加入 %胰蛋白酶到培養(yǎng)瓶中以剛好鋪滿培養(yǎng)瓶底部為宜 酶消化約 5分鐘顯微鏡下觀察到大部分細胞漂浮起來為宜 加入含血清的培養(yǎng)液終止消化 移入離心管 15002022轉(zhuǎn) /分鐘離心 6分鐘 棄掉上清液 加入培養(yǎng)液重懸細胞把細胞輕輕吹散后放入細胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)一般是 1：3傳 每隔 23天換液一次，并每天要觀察細胞形態(tài)變化。 ?細胞冷凍 細胞凍存和復蘇是細胞培養(yǎng)不可缺少的步驟。為了避免細胞在體外長期培養(yǎng)時丟失，對細胞要及時凍存。但當細胞離開活體開始原代培養(yǎng)后，它的各種生物學特性都將逐漸發(fā)生變化，并隨著傳代次數(shù)的增加和體外培養(yǎng)條件的變化而不斷有新的變化。因此，及時凍存低代細胞是很必要的（ 一般冷凍 23代細胞為宜 ）。 ?細胞冷凍原理 在不加保護條件下直接凍存細胞時，細胞內(nèi)和外環(huán)境中的水會形成結(jié)晶，能導致細胞內(nèi)發(fā)生一系列變化，如電解質(zhì)濃度升高、滲透壓改變、脫水、等，能引起細胞死亡。 向培養(yǎng)基中加入保護劑甘油或 二甲基亞砜（ DMSO）， 可使冰點降低，在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細胞外。貯存在－ 130℃ 以下低溫中能減少冰晶的形成。溶解細胞時，速度要快，使之迅速通過細胞最易受損的－ 5℃ ～ 0℃ 。 ?冷凍方法 ? 1. 選用對數(shù)生長期細胞，在收集細胞 24h前換液一次。 ? 2. 用常規(guī)胰蛋白酶消化將細胞消化下來，按 106107/ml細胞濃度，懸浮于含 10％ DMSO的培養(yǎng)液中（此時培養(yǎng)液要冷的，因 DMSO仔常溫下可以產(chǎn)生毒性） ? 3. 用吸管吸取細胞懸液，分裝于 存管中用火燒封口。 ? 4. 凍存 4℃ 半個小時 20℃ 2小時 80℃ 過夜液氮長期保存。 ?解凍方法 ? 1．將凍存于液氮中的凍存管取出，迅速放入37℃ 水浴中使其在 1min內(nèi)融化。 ? 2. 用 75%酒精噴細胞冷凍細管用滅菌過的紗布擦試細管 用滅菌過剪刀剪掉細管 2頭 將細胞懸液移至離心管中，補加培養(yǎng)液， 1500rpm低速離心 6min，去上清（ DMSO 在常溫下對細胞有毒，應在細胞復蘇后盡量除去） 棄掉上清液、加培養(yǎng)液進行培養(yǎng) 第二天待細胞貼壁時進行換液把死的細胞去除 后每隔 23天換液 待細胞生長至一定密度后即可傳代。（ 解凍方法速度一定要快） ?細胞活力 將細胞懸液以 。 加入 %臺盼蘭染液，染色 2一 3分鐘。 吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。 鏡下取幾個任意視野分別計死細胞和活細胞數(shù)，計細胞活力。 死細胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色
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