【文章內(nèi)容簡介】 的產(chǎn)物 ? 起源于非合子細(xì)胞 ? 發(fā)育過程與合子胚相似，也經(jīng)歷球形期、心形期、 魚雷期和子葉期階段。 ? B: 體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑 ? 胚狀體可從離體培養(yǎng)的各種外植體上直接或間接地發(fā)生，大致分為五種： 直接從器官外植體上發(fā)生 愈傷組織發(fā)生 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生 單倍體細(xì)胞發(fā)生 原生質(zhì)體發(fā)生 人工種子概念 ? 利用人工種皮包被體細(xì)胞胚可以制造人工種子。 人工種子的結(jié)構(gòu) ? 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用的天然種子，一般都是由種被、胚乳和胚三部分構(gòu)成。 ? 目前研制的人工種子的結(jié)構(gòu) : 體細(xì)胞胚 人工種皮 人工胚乳 ? 人工種子的基本制作流程 外植體的選擇和消毒 —— 愈傷組織的誘 導(dǎo) —— 體細(xì)胞胚的誘導(dǎo) —— 體細(xì)胞胚的 同步化 —— 體細(xì)胞胚的分選 —— 體細(xì)胞胚 的包裹 (人工胚乳 )—— 包裹外膜 —— 發(fā)芽 成苗試驗(yàn) —— 體細(xì)胞胚變異程度與農(nóng)藝研 究。 ? 人工種子制作過程中， 包埋 是最重要環(huán)節(jié) ? 包括包埋介質(zhì)的選擇，主要是 人工胚乳 和人工種皮 的選擇 ? 人工胚乳一般由含有供應(yīng)胚狀體養(yǎng)分的膠囊組成 ,養(yǎng)分包括礦質(zhì)元素、維生素、碳源以及激素等 ? 對于人工胚乳包埋介質(zhì)的要求： ? 首先必需是對繁殖體及其它生物是無毒的，并具有一定的緩沖強(qiáng)度，以保證繁殖體在生產(chǎn)、運(yùn)輸和種植操作中的安全。 ? 同時(shí)，它最好能夠提供類似于胚乳的營養(yǎng)物質(zhì)，以供繁殖體發(fā)芽的需要。 ? 此外由于繁殖體的含水量較高，貯存中極易受到微生物感染危害，因此介質(zhì)中還應(yīng)含有適當(dāng)?shù)臍⒕鷦? ? 海藻酸鈉作包埋劑 人工種子優(yōu)點(diǎn)： ? 第一，它同微繁殖技術(shù)一樣，培養(yǎng)條件可以人為控制，免遭大自然災(zāi)害性氣候的不利因素，且具有省地省工可直接在田間播種等優(yōu)點(diǎn)。 ? 第二，在人工種子制作中，可加入營養(yǎng)物質(zhì)、植物生長調(diào)節(jié)劑、固氮菌、殺蟲劑等，這是微繁殖難以達(dá)到的。 ? 第三，用于制作人工種子的體細(xì)胞胚，可利用生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)，大大提高了效率。 ? 第四，一些難以得到天然種子的珍稀植物或脫毒苗、基因工程植株，均可利用人工種子技術(shù)加速用于生產(chǎn)。 植物細(xì)胞培養(yǎng) ? ? 概念： 離體條件下，將愈傷組織或其他易分散的組織置于液體培養(yǎng)基中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。得到分散成游離的懸浮細(xì)胞，通過繼代培養(yǎng)使細(xì)胞增殖。從而獲得大量細(xì)胞群體的一種技術(shù)。 ? 方法： ? 根據(jù)對象：單細(xì)胞培養(yǎng)、單倍體培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)。 ? 按培養(yǎng)系統(tǒng)：懸浮培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)、固定化培養(yǎng) ? 圖 37 植物單細(xì)胞培養(yǎng) ? 單細(xì)胞制備方法 ? 由完整的植物器官分離單細(xì)胞由培養(yǎng)組織中分離單細(xì)胞 A: 機(jī)械法 ：通過機(jī)械磨碎、切割植物體獲得游離單細(xì)胞。 B: 酶解法： 采用水解酶去除細(xì)胞壁，釋放出細(xì)胞，用來制備原生質(zhì)體。 ? 葉片是分離單細(xì)胞的最好材料 機(jī)械法 露出葉肉細(xì)胞 用解剖刀刮下細(xì)胞 撕去下表皮 加果膠酶 過濾、離心 Takebe等（ 1968）最早報(bào)道：用果膠酶處理可以分離大量的葉肉細(xì)胞 ? C: 愈傷組織誘導(dǎo)法 ：先獲得愈傷組織，在通過震蕩獲得單個細(xì)胞 ? 步驟： ? (1) 誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織； ? (2) 愈傷組織反復(fù)繼代，使組織不斷增殖，提高愈傷組織的松散性。 ? (3)將愈傷組織在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，建立懸浮培養(yǎng)物。 愈傷組織 液體培養(yǎng)基 搖床振蕩 懸浮培養(yǎng) 質(zhì)地疏松，細(xì)胞分散程度大； 質(zhì)地緊密，細(xì)胞分散程度小，不適于懸浮培養(yǎng) 轉(zhuǎn)速 30150rpm 23cm沖程 防細(xì)胞破裂 單細(xì)胞培養(yǎng)方法 ? A: 平板培養(yǎng)法 ? 概念：將制備好的單細(xì)胞懸浮液，按照一定的細(xì)胞密度，接種在 1mm左右的薄層固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，稱之為平板培養(yǎng) ? 單細(xì)胞懸浮液的制備 ? 懸浮細(xì)胞密度的調(diào)制 ? 瓊脂培養(yǎng)基的配制 ? 平板制作 ? 培養(yǎng) ? 主要技術(shù)要點(diǎn)： ? 單細(xì)胞的分離： 一般采用酶分離法，小細(xì)胞團(tuán)不能超過 6個細(xì)胞，因此過濾時(shí)網(wǎng)篩的網(wǎng)眼要選擇合適。 單細(xì)胞懸浮液的制備 ：分離的單細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)基洗滌 2次以后，調(diào)整密度為 103或 105個細(xì)胞 /ml ? 植板： 將 1份已調(diào)整好密度的單細(xì)胞懸浮液與 35℃ 的固體培養(yǎng)基充分混合均勻，然后均勻的平鋪與培養(yǎng)皿中，其厚度為 12mm。 待植板后的培養(yǎng)基完全凝固后，將培養(yǎng)皿封嚴(yán)以防污染 .在 25℃ 黑暗條件下培養(yǎng) 3周即可長出肉眼可見的愈傷組織。 ? 特點(diǎn)： ? 單細(xì)胞在培養(yǎng)集中分布均勻，便于顯微鏡下定點(diǎn)觀察； ? 培養(yǎng)細(xì)胞氣體交換不暢。 平板培養(yǎng)法 ? B: 看護(hù)培養(yǎng)法 ? 用一塊活躍生長的愈傷組織塊來看護(hù)單個細(xì)胞，并使其生長和增殖的方法。 ? （ 1）取處于活躍生長期約 1厘米大小愈傷組織塊。 ? （ 2）無菌條件下，愈傷組織塊安放在培養(yǎng)瓶中，在愈傷組織上放約 1厘米平方的無菌濾紙片。置培養(yǎng)室中放過夜。 ? （ 3）將分離出的單細(xì)胞接種在培養(yǎng)瓶中的濾紙上面。 ? （ 4）恒溫培養(yǎng)。 ? 特點(diǎn)： ? （ 1）效果好，易于成功。 ? （ 2）簡便易行。 ? （ 3）不能在顯微鏡下直接觀察細(xì)胞的生長過程。 ? C: 微室培養(yǎng)法 ? 人工制造一個小室（載玻片和蓋玻片），將單細(xì)胞培養(yǎng)在小室中的少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖成細(xì)胞團(tuán)的方法。小室可通過毛細(xì)管與外界通氣，便于觀察。 微室培養(yǎng) 1滴含單細(xì)胞培養(yǎng)液 周圍加石蠟油 凹穴載玻片 旁邊加石蠟油 蓋蓋玻片 蓋蓋玻片 平視圖 置培養(yǎng)皿中 26~28 ℃ 恒溫培養(yǎng) ? 特點(diǎn)： ? 在培養(yǎng)過程中可以連續(xù)進(jìn)行顯微觀察，將一個細(xì)胞的生長、分裂和形成細(xì)胞團(tuán)的全部過程記錄下來。 D: 其它單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 飼養(yǎng)層培養(yǎng)基技術(shù) 是用處理過的、無活性或分裂慢的細(xì)胞來飼養(yǎng)所需培養(yǎng)的細(xì)胞，使其分裂和生長。 將飼養(yǎng)細(xì)胞先用射線輻射處理，然后將飼養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)細(xì)胞混合植板，經(jīng)過照射的細(xì)胞對于培養(yǎng)細(xì)胞起到一個飼養(yǎng)作用。 雙層濾紙植板培養(yǎng)方法 培養(yǎng)基 飼養(yǎng)層細(xì)胞 看護(hù)濾紙層 轉(zhuǎn)移碟濾紙 培養(yǎng)細(xì)胞 ? E: 懸浮培養(yǎng) ? 懸浮培養(yǎng)是指將單個游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。 起始培養(yǎng)物的建立 ? 選擇適宜的外植體：幼胚、胚軸、子葉是最常使用的外植體。 選擇適宜的培養(yǎng)基： 較高濃度激素濃度；必要的附加物質(zhì)。 ? 愈傷組織的要求：松散性好、增殖快、再生能力強(qiáng) ? 懸浮培養(yǎng)與固體培養(yǎng)比較有三個優(yōu)點(diǎn)： ? 一、增加培養(yǎng)細(xì)胞與培養(yǎng)液的接觸面，改善營養(yǎng)供應(yīng)；可以適當(dāng)改善氣體的交換 ? 二、在振蕩條件下可避免細(xì)胞代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)在局部積累而對細(xì)胞自身產(chǎn)生毒 ? 害； ? 三、適合大規(guī)模培養(yǎng)。生產(chǎn)有價(jià)值次生代謝產(chǎn)物。 建立細(xì)胞懸浮系 ? 一個成功的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系必須滿足三個條件： ? 懸浮培養(yǎng)物分散性良好，細(xì)胞團(tuán)較小，一般在30～ 50個細(xì)胞以下，在實(shí)際培養(yǎng)中很少有完全由單細(xì)胞組成的植物細(xì)胞懸浮系。 ? 均一性好，細(xì)胞形狀和細(xì)胞團(tuán)大小大致相同。懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細(xì)胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。 ? 細(xì)胞生長迅速，懸浮細(xì)胞的生長量一般 2～ 3天甚至更短時(shí)間便可增加一倍。 104 懸浮培養(yǎng)中細(xì)胞生長量的計(jì)算 ?細(xì)胞計(jì)數(shù) ?細(xì)胞密實(shí)體積（ PCV） 5％鉻酸或 ％果膠酶使懸浮細(xì)胞團(tuán)分散 用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行。 將體積已知、均勻分散的懸浮液放入一個 15ml 的離心管中， 2022轉(zhuǎn)下離心，用每 ml培養(yǎng)液中細(xì)胞總體積的 ml數(shù)表示 ?細(xì)胞鮮重： 細(xì)胞培養(yǎng)物過濾，洗去培養(yǎng)基，真空抽慮，稱重。 ?細(xì)胞干重 離心收集的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到預(yù)先稱重的濾紙片上，然后在 60℃ 烘 12h，在干燥器中冷卻后稱重 懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的同步化 ? 細(xì)胞同步化是指同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細(xì)胞都同時(shí)通過細(xì)胞周期的某一特定時(shí)期。 ? 物理方法 ? 1）分選法 通過細(xì)胞體積大小分級，直接將處于相同