【文章內(nèi)容簡介】 的產(chǎn)物 ? 起源于非合子細胞 ? 發(fā)育過程與合子胚相似，也經(jīng)歷球形期、心形期、 魚雷期和子葉期階段。 ? B: 體細胞胚胎發(fā)生途徑 ? 胚狀體可從離體培養(yǎng)的各種外植體上直接或間接地發(fā)生，大致分為五種： 直接從器官外植體上發(fā)生 愈傷組織發(fā)生 懸浮培養(yǎng)細胞發(fā)生 單倍體細胞發(fā)生 原生質(zhì)體發(fā)生 人工種子概念 ? 利用人工種皮包被體細胞胚可以制造人工種子。 人工種子的結(jié)構(gòu) ? 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用的天然種子，一般都是由種被、胚乳和胚三部分構(gòu)成。 ? 目前研制的人工種子的結(jié)構(gòu) : 體細胞胚 人工種皮 人工胚乳 ? 人工種子的基本制作流程 外植體的選擇和消毒 —— 愈傷組織的誘 導(dǎo) —— 體細胞胚的誘導(dǎo) —— 體細胞胚的 同步化 —— 體細胞胚的分選 —— 體細胞胚 的包裹 (人工胚乳 )—— 包裹外膜 —— 發(fā)芽 成苗試驗 —— 體細胞胚變異程度與農(nóng)藝研 究。 ? 人工種子制作過程中， 包埋 是最重要環(huán)節(jié) ? 包括包埋介質(zhì)的選擇，主要是 人工胚乳 和人工種皮 的選擇 ? 人工胚乳一般由含有供應(yīng)胚狀體養(yǎng)分的膠囊組成 ,養(yǎng)分包括礦質(zhì)元素、維生素、碳源以及激素等 ? 對于人工胚乳包埋介質(zhì)的要求： ? 首先必需是對繁殖體及其它生物是無毒的，并具有一定的緩沖強度，以保證繁殖體在生產(chǎn)、運輸和種植操作中的安全。 ? 同時，它最好能夠提供類似于胚乳的營養(yǎng)物質(zhì)，以供繁殖體發(fā)芽的需要。 ? 此外由于繁殖體的含水量較高，貯存中極易受到微生物感染危害，因此介質(zhì)中還應(yīng)含有適當(dāng)?shù)臍⒕鷦? ? 海藻酸鈉作包埋劑 人工種子優(yōu)點： ? 第一，它同微繁殖技術(shù)一樣，培養(yǎng)條件可以人為控制，免遭大自然災(zāi)害性氣候的不利因素，且具有省地省工可直接在田間播種等優(yōu)點。 ? 第二，在人工種子制作中，可加入營養(yǎng)物質(zhì)、植物生長調(diào)節(jié)劑、固氮菌、殺蟲劑等，這是微繁殖難以達到的。 ? 第三，用于制作人工種子的體細胞胚，可利用生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)，大大提高了效率。 ? 第四，一些難以得到天然種子的珍稀植物或脫毒苗、基因工程植株，均可利用人工種子技術(shù)加速用于生產(chǎn)。 植物細胞培養(yǎng) ? ? 概念： 離體條件下，將愈傷組織或其他易分散的組織置于液體培養(yǎng)基中進行振蕩培養(yǎng)。得到分散成游離的懸浮細胞，通過繼代培養(yǎng)使細胞增殖。從而獲得大量細胞群體的一種技術(shù)。 ? 方法： ? 根據(jù)對象：單細胞培養(yǎng)、單倍體培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)。 ? 按培養(yǎng)系統(tǒng)：懸浮培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)、固定化培養(yǎng) ? 圖 37 植物單細胞培養(yǎng) ? 單細胞制備方法 ? 由完整的植物器官分離單細胞由培養(yǎng)組織中分離單細胞 A: 機械法 ：通過機械磨碎、切割植物體獲得游離單細胞。 B: 酶解法： 采用水解酶去除細胞壁，釋放出細胞，用來制備原生質(zhì)體。 ? 葉片是分離單細胞的最好材料 機械法 露出葉肉細胞 用解剖刀刮下細胞 撕去下表皮 加果膠酶 過濾、離心 Takebe等（ 1968）最早報道：用果膠酶處理可以分離大量的葉肉細胞 ? C: 愈傷組織誘導(dǎo)法 ：先獲得愈傷組織，在通過震蕩獲得單個細胞 ? 步驟： ? (1) 誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織； ? (2) 愈傷組織反復(fù)繼代，使組織不斷增殖，提高愈傷組織的松散性。 ? (3)將愈傷組織在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，建立懸浮培養(yǎng)物。 愈傷組織 液體培養(yǎng)基 搖床振蕩 懸浮培養(yǎng) 質(zhì)地疏松，細胞分散程度大； 質(zhì)地緊密，細胞分散程度小，不適于懸浮培養(yǎng) 轉(zhuǎn)速 30150rpm 23cm沖程 防細胞破裂 單細胞培養(yǎng)方法 ? A: 平板培養(yǎng)法 ? 概念：將制備好的單細胞懸浮液，按照一定的細胞密度，接種在 1mm左右的薄層固體培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，稱之為平板培養(yǎng) ? 單細胞懸浮液的制備 ? 懸浮細胞密度的調(diào)制 ? 瓊脂培養(yǎng)基的配制 ? 平板制作 ? 培養(yǎng) ? 主要技術(shù)要點： ? 單細胞的分離： 一般采用酶分離法，小細胞團不能超過 6個細胞，因此過濾時網(wǎng)篩的網(wǎng)眼要選擇合適。 單細胞懸浮液的制備 ：分離的單細胞經(jīng)培養(yǎng)基洗滌 2次以后，調(diào)整密度為 103或 105個細胞 /ml ? 植板： 將 1份已調(diào)整好密度的單細胞懸浮液與 35℃ 的固體培養(yǎng)基充分混合均勻，然后均勻的平鋪與培養(yǎng)皿中，其厚度為 12mm。 待植板后的培養(yǎng)基完全凝固后，將培養(yǎng)皿封嚴(yán)以防污染 .在 25℃ 黑暗條件下培養(yǎng) 3周即可長出肉眼可見的愈傷組織。 ? 特點： ? 單細胞在培養(yǎng)集中分布均勻，便于顯微鏡下定點觀察； ? 培養(yǎng)細胞氣體交換不暢。 平板培養(yǎng)法 ? B: 看護培養(yǎng)法 ? 用一塊活躍生長的愈傷組織塊來看護單個細胞，并使其生長和增殖的方法。 ? （ 1）取處于活躍生長期約 1厘米大小愈傷組織塊。 ? （ 2）無菌條件下，愈傷組織塊安放在培養(yǎng)瓶中，在愈傷組織上放約 1厘米平方的無菌濾紙片。置培養(yǎng)室中放過夜。 ? （ 3）將分離出的單細胞接種在培養(yǎng)瓶中的濾紙上面。 ? （ 4）恒溫培養(yǎng)。 ? 特點： ? （ 1）效果好，易于成功。 ? （ 2）簡便易行。 ? （ 3）不能在顯微鏡下直接觀察細胞的生長過程。 ? C: 微室培養(yǎng)法 ? 人工制造一個小室（載玻片和蓋玻片），將單細胞培養(yǎng)在小室中的少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖成細胞團的方法。小室可通過毛細管與外界通氣，便于觀察。 微室培養(yǎng) 1滴含單細胞培養(yǎng)液 周圍加石蠟油 凹穴載玻片 旁邊加石蠟油 蓋蓋玻片 蓋蓋玻片 平視圖 置培養(yǎng)皿中 26~28 ℃ 恒溫培養(yǎng) ? 特點： ? 在培養(yǎng)過程中可以連續(xù)進行顯微觀察，將一個細胞的生長、分裂和形成細胞團的全部過程記錄下來。 D: 其它單細胞培養(yǎng)技術(shù) 飼養(yǎng)層培養(yǎng)基技術(shù) 是用處理過的、無活性或分裂慢的細胞來飼養(yǎng)所需培養(yǎng)的細胞，使其分裂和生長。 將飼養(yǎng)細胞先用射線輻射處理，然后將飼養(yǎng)細胞和培養(yǎng)細胞混合植板，經(jīng)過照射的細胞對于培養(yǎng)細胞起到一個飼養(yǎng)作用。 雙層濾紙植板培養(yǎng)方法 培養(yǎng)基 飼養(yǎng)層細胞 看護濾紙層 轉(zhuǎn)移碟濾紙 培養(yǎng)細胞 ? E: 懸浮培養(yǎng) ? 懸浮培養(yǎng)是指將單個游離細胞或小細胞團在液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。 起始培養(yǎng)物的建立 ? 選擇適宜的外植體：幼胚、胚軸、子葉是最常使用的外植體。 選擇適宜的培養(yǎng)基： 較高濃度激素濃度；必要的附加物質(zhì)。 ? 愈傷組織的要求：松散性好、增殖快、再生能力強 ? 懸浮培養(yǎng)與固體培養(yǎng)比較有三個優(yōu)點： ? 一、增加培養(yǎng)細胞與培養(yǎng)液的接觸面，改善營養(yǎng)供應(yīng)；可以適當(dāng)改善氣體的交換 ? 二、在振蕩條件下可避免細胞代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)在局部積累而對細胞自身產(chǎn)生毒 ? 害； ? 三、適合大規(guī)模培養(yǎng)。生產(chǎn)有價值次生代謝產(chǎn)物。 建立細胞懸浮系 ? 一個成功的懸浮細胞培養(yǎng)體系必須滿足三個條件： ? 懸浮培養(yǎng)物分散性良好，細胞團較小，一般在30～ 50個細胞以下，在實際培養(yǎng)中很少有完全由單細胞組成的植物細胞懸浮系。 ? 均一性好，細胞形狀和細胞團大小大致相同。懸浮系外觀為大小均一的小顆粒，培養(yǎng)基清澈透亮，細胞色澤呈鮮艷的乳白或淡黃色。 ? 細胞生長迅速，懸浮細胞的生長量一般 2～ 3天甚至更短時間便可增加一倍。 104 懸浮培養(yǎng)中細胞生長量的計算 ?細胞計數(shù) ?細胞密實體積（ PCV） 5％鉻酸或 ％果膠酶使懸浮細胞團分散 用血球計數(shù)板進行。 將體積已知、均勻分散的懸浮液放入一個 15ml 的離心管中， 2022轉(zhuǎn)下離心，用每 ml培養(yǎng)液中細胞總體積的 ml數(shù)表示 ?細胞鮮重： 細胞培養(yǎng)物過濾，洗去培養(yǎng)基，真空抽慮，稱重。 ?細胞干重 離心收集的細胞轉(zhuǎn)移到預(yù)先稱重的濾紙片上，然后在 60℃ 烘 12h，在干燥器中冷卻后稱重 懸浮細胞培養(yǎng)的同步化 ? 細胞同步化是指同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細胞都同時通過細胞周期的某一特定時期。 ? 物理方法 ? 1）分選法 通過細胞體積大小分級，直接將處于相同