細胞培養(yǎng)技術修改版(編輯修改稿)
2024-12-12 01:00 本頁面
【文章內容簡介】 數(shù)板上蓋玻片的一側加該細胞懸液，加樣量不要溢出蓋玻片，也不要過少或帶氣泡。計算細胞濃度。 用 RPMI1640 制備成 1 106/ml 濃度的細胞懸液，并按 10％的量加入小牛血清。 將上述細胞懸液分裝 5ml 到新細胞瓶中，塞好塞子，標記后送培養(yǎng)箱培養(yǎng)， 9 24h 后觀察。 五、實驗結果 顯微鏡下觀察 Hep2 細胞生長良好，已長滿單層，細胞呈不規(guī)則多邊形，透光性良好。 實驗五 VSV TCID50滴定 一、實驗目的 掌握病毒 TCID50滴定的基本原理和計算方 法以及應用。 二、實驗原理 多數(shù)病毒感染體外培養(yǎng)的細胞后，常引起細胞形態(tài)學改變，如細胞團縮、裂解和細胞腫大等，這種改變稱為病毒致病變效應（ cytopathic effect， CPE），可以直接通過顯微鏡觀察，亦可通過染色得以識別和判斷。 CPE 的程度可間接反映病毒的毒力，因此利用這種特征可以用來測定病毒的毒力。即能在半數(shù)細胞培養(yǎng)板孔或試管內引起細胞發(fā)生病變所需的病毒量定義為病毒的 50％組織細胞感染指數(shù)（ 50％ tissue culture infectious dose， TCID50）。 測定時，首先在微 量細胞板上培養(yǎng)敏感細胞，待細胞貼壁形成單層，棄上清。將待測病毒用維持液做 10 倍稀釋后加入細胞單層，逐日觀察，直至病毒產(chǎn)生的 CPE不再進展為止。具體時間根據(jù)病毒的增殖特點而定，如腸道病毒增殖迅速，一般 48h即可； VSV 增殖也較快，因此， 48h～ 72h 也可以觀察、染色、計算。 三、實驗材料 細胞： Hep2細胞株（實驗四傳代所得），自備 /組。 病毒：水泡性口炎病毒（ vesicular stomatitis virus， VSV），自備 /組。 試劑：維持液， PBS， VTP 等自備 /組。 材料：細胞板（ 1塊 /組）， tip 頭（ 2盒 /排），微量移液器， 5ml 或 10ml 吸管（ 2支 /組），青霉素瓶帶塞（ 10個 /排），酒精缸，鑷子（ 2個 /排） 四、操作步驟 制備細胞：方法同實驗四。一瓶細胞消化后加入營養(yǎng)液制成所需細胞懸液，濃度約為 1 106/ml。用微量移液器將細胞懸液加入 40孔板微孔中，每孔 100μ l， 10 37℃， 5%CO2孵育箱培養(yǎng) 24h，形成單層后，做病毒滴定用。 50%組織細胞感染量（ TCID50）測定 （ 1）稀釋病毒液：取無菌青霉素瓶 9支，各管分別加 3%小牛血清的維持液 ，然后向第一管加 VSV 病毒液 ，反復吹吸混合三次，從第一管內吸液 加入第二管內，反復混合三次，從第二管內吸液 加入第三管內，反復混合三次，依此類推將待測的病毒液做連續(xù) 10 倍稀釋，使病毒稀釋為 101， 102， 103? 109。 （ 2）病毒接種：將長好單層細胞的培養(yǎng)板各孔細胞液全部傾棄，用微量移液器把各稀釋度的 VSV 病毒從低濃度開始依次加入各微孔中，每稀釋度平行加 2 孔，每孔 100μ l。細胞對照孔不加病毒液，只加維持液。置 37℃， 5%CO2孵育箱中孵育。 （ 3）結果觀察：于孵育 后 1 2 3 4 72h 在倒置顯微鏡下觀察 CPE，病毒可引起細胞圓縮、堆聚及脫落現(xiàn)象?！?”表示細胞正常；“ +” 25%細胞產(chǎn)生病變、圓縮、破碎脫落；“ 2+” 50%細胞產(chǎn)生病變；“ 3+” 75%細胞產(chǎn)生病變；“ 4+” 100%細胞產(chǎn)生病變。（實驗時，觀察 24h~48h 即可染色計算） 計算 TCID50參見下表 表 VSV在 Hep2 細胞上的 TCID50結果記錄 病毒稀釋度 病變孔數(shù) /接種孔數(shù) 累積數(shù)（孔） 病變細胞孔 有病變 ↑ 無病變 ↓ 比例 百分比（ %） 103 8/8 10 0 10/10 100 104 2/8 2 6 2/8 25 105 0/8 0 14 0/14 0 106 0/8 0 22 0/22 0 107 0/8 0 30 0/30 0 108 0/8 0 38 0/38 0 按表中， 103稀釋的病變高于 50%； 104稀釋的病變低于 50%； 50%病變分布于 103與 104之間，計算公式如下： 高于 50%病變率 （ 50%） 10050 距離比例 = lg稀釋倍數(shù) = lg10 高于 50%的病變率 低于 50%的病變率 10025 = lg TCID50=高于 50%病變的低稀釋度對數(shù) +距離比 =3+()= 即 1 個 TCID50=，查 的反對數(shù)為 ，即病毒做 103倍稀釋時取 接種細胞，即可使 50%細胞產(chǎn)生病變。 11 附錄：如何計算 200 個 TCID50？ 103247。 200=，將病毒作 倍稀釋時即得 200 個 TCID50。 五、計算 請計算提供的病毒的 TCID50。 六、寫實驗報告并計算給定的病毒的 TCID50。 實驗六 干擾素活性（效價）的測定 （注：此實驗所需的細胞為實驗四時傳代培養(yǎng)所得） 一、實驗目的 掌握微量細胞病變抑制法測定干擾素效價的基本步驟以及結果分析。 熟悉常用生物制品生物學活性測定的實際意義。 了解影響結果的常見因素。 二、基 本原理 病毒或其他干擾素誘生劑作用于巨噬細胞、 T 細胞或成纖維細胞后，由細胞基因自身編碼產(chǎn)生的具有抗病毒、抗腫瘤和調節(jié)免疫功能的一類小分子糖肽，統(tǒng)稱為干擾素。干擾素發(fā)揮重要的酶的特性而抑制病毒 DNA 和蛋白質的合成，從而抑制病毒在細胞內的增殖。因此具有間接的廣譜抗病毒作用。 為了進一步確定人工方法制備的干擾素的生物學活性，需進行體外抗病毒試驗測定，即干擾素效價的測定。干擾素效價一般定義為：凡 1ml 干擾素標本的最高稀釋度仍能保護半數(shù)細胞（ 50％）免受 “ 攻擊病毒 ” 損害者，該稀釋度的倒數(shù)即為干擾素的效價，即單位 /毫升 。 三、測定方法 測定干擾素效價的方法有多種，最常用的是 “ 細胞病變抑制法 ” （ Method of
研究報告相關推薦
鄂ICP備17016276號-1