細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)修改版-資料下載頁(yè)
2024-11-06 01:00本頁(yè)面
【導(dǎo)讀】后緩慢加濃硫酸。攪拌溶解后過(guò)濾除菌，每瓶按100ml分裝，塞好大翻，并注明名稱配制日期和組別。2020ml大酒精瓶1只；無(wú)菌100ml鹽水瓶20只。無(wú)菌％NaHCO350ml按照3ml/瓶分裝，每室16瓶，每小組1瓶。無(wú)菌青霉素瓶20只；無(wú)菌5ml吸管1支。按照1ml/瓶分裝，每室15瓶。按5ml/瓶分裝，瓶口貼好膠布?！钗刺貏e說(shuō)明上述試劑均放置2～8℃冰箱保存?zhèn)溆?。熟悉病毒在?xì)胞內(nèi)增殖的基本判斷方法。肉細(xì)胞的收縮功能；上皮細(xì)胞的分泌功能等。原代細(xì)胞最接近體內(nèi)。作用機(jī)制等的研究。5或10ml吸管4支，1或5ml吸管1支，長(zhǎng)青霉素瓶2只（帶塞）；Hanks’液1瓶，RPMI-16401瓶，雙抗1瓶；15mlHank’s液至無(wú)菌平皿中備用；皿①中，小心去頭、內(nèi)臟、爪和粘液及血球，洗滌后置于盛有Hank’s液的平皿②中，約～1mm3的小塊，此時(shí)體積約；用Hanks’液洗滌兩次。消化停止的標(biāo)志是：輕輕晃動(dòng)后細(xì)胞懸起，呈云霧狀，很快聚集成團(tuán)，表明細(xì)胞活力好。充分吹打，使細(xì)胞充分分散。
【正文】 計(jì)算法（通常按照 ReedMuench 法計(jì)算） 第一步 計(jì)算保護(hù)百分比，見(jiàn)下表 A 項(xiàng) B 項(xiàng) C 項(xiàng) D 項(xiàng) E 項(xiàng) F 項(xiàng) G 項(xiàng) 干擾素稀釋度 病變細(xì)胞 正常細(xì)胞 平均數(shù) 累積 比例 百分比（％） 管 1 管 2 管 1 管 2 病變 正常 病變（↓） 正常（↑） 正常 /(正常＋病變 ) 1： 400（ 2－ 2 10－ 2） 1： 800（ 2 － 3 10－ 2 ） 1： 1600 （ 2 － 4 10－ 2 ） 1： 3200 （ 2－ 5 10－ 2 ） 1： 6400 （ 2 － 6 10 － 2 ） 1： 12800 （ 2 － 7 10－ 2 ） 1： 25600 （ 2 － 8 10－ 2 ） 1： 51200 （ 2 － 9 10－ 2 ） 0 0 1 2 2 3 4 4 0 0 1 2 2 3 4 4 4 4 3 2 2 1 0 0 4 4 3 2 2 1 0 0 0 0 1 2 2 3 4 4 4 4 3 2 2 1 0 0 0 0 1 3 5 8 12 16 16 12 8 5 3 1 0 0 16 /16 12 /12 8 /9 5 /8 3 /8 1 /9 0 0 100 100 89 63 38 11 0 0 A、 B、 C 項(xiàng)為原始數(shù)據(jù)， 4＋表示全部細(xì)胞病變； 3＋表示 75％細(xì)胞病變； 15 2＋表示 50％細(xì)胞病變； 1＋表示 25％細(xì)胞病變。 第二步 求出干擾素單位 從上表中可大略看出，此批干擾素能保護(hù)半數(shù)（ 50％）細(xì)胞不被 “攻擊病毒 ”損害的最高稀釋度在 1:3200～ 1:6400 之間。因此，可通過(guò)下式求出其距離比。 高于 50％的百分比－ 50 63－ 50 距離比＝ ＝ ＝ 高于 50％的百分比－低于 50％的百分比 63－ 38 即此批干擾素稀釋到 2－ 10－ 2（ 1:4588） 時(shí)，能保護(hù)半數(shù)細(xì)胞免受 “攻擊病毒 ”損害，其結(jié)果可記為 +2 單位 /毫升（ ＋ 2 u. ml－ 1）。 工作單位修正 各實(shí)驗(yàn)室所測(cè)得的干擾素單位，習(xí)慣上一般都稱為該實(shí)驗(yàn)室 “ 工作單位 ” 。為了表明某種干擾素效價(jià)的高低，就必須用同型國(guó)際干擾素參考制劑加以修正。例如，當(dāng)我們要修正本實(shí)驗(yàn)室所制備的獸用白細(xì)胞干擾素的效價(jià)時(shí)，就應(yīng)當(dāng)： （ 1）查明獸用白細(xì)胞干擾素參考制劑的標(biāo)準(zhǔn)單位 (R1) （ 2）并在相同條件下測(cè)出獸用白細(xì)胞干擾素參考制劑的工作單位（ R2） （ 3）測(cè)出本實(shí)驗(yàn)室所制獸用白細(xì)胞干擾素的工作單位 (X2) （ 4）按下式求出本室所制獸用白細(xì)胞干擾素的修正單位（ X1）： R1:X1 = R2： X2 例如設(shè)： R1=5000 單位， R2=10000 單位， X2= 8000 單位； 則按上式可求知： X1 = 4000 單位。 16 S1 S2 實(shí)驗(yàn)七 濾泡性口炎病毒（ VSV）中和試驗(yàn) （稀釋血清固定病毒法） 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 測(cè)定血清中的 VSV中和抗體效價(jià) 二、實(shí)驗(yàn)原理 特異的抗病毒 免疫血清（中和抗體）和病毒作用后，使病毒失去感染的能力，一種病毒只能被相應(yīng)的免疫血清所中和，中和一定量的病毒的感染力必須有一定效價(jià)的中和抗體。根據(jù)稀釋成分不同可分為兩種方法。一為固定病毒用量（ 100TCID50）與等量一系列倍比稀釋的血清進(jìn)行中和試驗(yàn)，以血清中和抗體滴度表示。二為固定血清用量與等量一系列對(duì)數(shù)稀釋的病毒進(jìn)行中和試驗(yàn)。結(jié)果以中和指數(shù)表示。 三、實(shí)驗(yàn)材料 VSV 動(dòng)物免疫血清（ S S2， 1:10 稀釋后 56℃ 30min 滅活）、 100TCID50VSV 病毒懸液、稀釋液（無(wú)血清 RPMI1640）、 營(yíng)養(yǎng)液（含 10％小牛血清的 RPMI1640）、40 孔平底細(xì)胞板、 Hep2 細(xì)胞一瓶、吸管、加樣器等。 四、實(shí)驗(yàn)步驟 40 孔板每孔加稀釋液 50μ l，作好標(biāo)記，按圖示進(jìn)行。每塊板做 2 個(gè)血清標(biāo)本（ S S2）。 S 對(duì)照 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 C 對(duì)照 V對(duì)照 取 1:10 滅活血清，第 2孔分別加入 50μ l；從第 2 孔吹吸 3 次，吸出 50μ l 至第 3 孔，吹吸 3 次，吸出 50μ l 至第 4 孔??依次直至第 8 孔，吸出 50μ l棄去。第 9孔細(xì)胞（ C）對(duì)照，第 10孔病毒（ V）對(duì)照均不加血清。 加入預(yù)先制配好 100TCID50 VSV 病毒懸液，每 50μ l/孔， C 對(duì)照及 S 對(duì)照不加病毒。最后每孔總量 100μ l， C 對(duì)照及 S 對(duì)照補(bǔ)充稀釋液至 100μ l/孔。 置 37℃ 溫箱，孵育 1h。 利用此 1小時(shí)制備 Hep2 細(xì)胞懸液并加入上述混合液中 。 Hep2 一瓶， PBS 洗滌 2 次 VTP 1ml 消化 約 5min 后傾去 37℃至細(xì)胞從玻璃瓶脫落 加入 1640 營(yíng)養(yǎng)液 6ml，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)成 1 106/ml，每孔加 100μ l 細(xì)胞懸液。 37℃ 5％ CO2孵育， 24h 觀察結(jié)果。 17 五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 用倒置顯微鏡觀察。首先觀察對(duì)照： V 對(duì)照（ 3+～ 4+）； S 對(duì)照（－ /177。）； C 對(duì)照（－）。以病變作為指標(biāo)，能抑制病毒 CPE 的血清最高稀釋度為中和抗體的效價(jià)（滴度）。
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