細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)修改版(已修改)
2024-11-22 01:00 本頁(yè)面
【正文】 1 實(shí)驗(yàn)一 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作 一、器材與藥品 （每實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備量） （一）普通器材 名 稱(chēng) 數(shù) 量 備 注 普通天平 1 臺(tái) 大酒精瓶 3 只 量筒 1000ml、 250ml各一只 500ml鹽水瓶 1 只 玻璃棒 2 支 火柴，標(biāo)簽紙，記號(hào)筆等 （二）無(wú)菌器材 名 稱(chēng) 數(shù) 量 備 注 100ml或 250ml鹽水瓶 70 只 大翻 70 個(gè) 10ml吸管 3 支 5ml吸管 5 支 1ml吸管 1 支 青霉素瓶 120 只 青霉素瓶塞 120 個(gè) （三）藥品 名 稱(chēng) 數(shù) 量 備 注 重鉻酸鉀 2400g 濃 H2SO4 4000ml 雙蒸水 5000ml 由技術(shù)室提前準(zhǔn)備 青霉素 10000 單位 /ml 鏈霉素 10 000μ g/ml NaHCO3， KCl ， NaCl，Na2HPO412H2O， KH2PO4，結(jié)晶紫，甲醛，無(wú)水酒精等 2 二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 （一）配清潔液 成 分 量 備 注 重鉻酸鉀 2400g 重鉻酸鉀溶于水中有時(shí)不能完全溶解，預(yù)先用2020ml熱水助其溶解，再加入 足量自來(lái)水，最后緩慢加濃硫酸。 濃硫酸 4000ml 自來(lái)水 20200ml 切記：濃硫酸要緩慢加入，且邊加邊攪拌！ （二）其他培養(yǎng)用液的配制及分工 （學(xué)生分為三大組） RPMI1640 培養(yǎng)液 成分 量 備 注 RPMI1640 2 袋 攪拌溶解后過(guò)濾除菌，每瓶按 100ml分裝，塞好大翻，并注明名稱(chēng)配制日期和組別。每實(shí)驗(yàn)室 20 瓶。每小組 1 瓶。 NaHCO3 g 2020ml 大酒精瓶 1 只；無(wú)菌 100ml 鹽水瓶 20 只。 無(wú)菌分裝 ％ NaHCO3 成分 量 備 注 無(wú)菌 ％ NaHCO3 50ml 按照 3ml/瓶分裝，每室 16 瓶，每小組 1 瓶。無(wú)菌操作。 無(wú)菌青霉素瓶 20 只；無(wú)菌 5ml 吸管 1 支。 無(wú)菌分裝 1％胰酶 （技術(shù)室提供） 按照 1ml/瓶分裝，每室 15 瓶。每小組 1 瓶。 成分 量 備 注 無(wú)菌 1％胰酶 20ml 按照 1ml/瓶分裝，每室 16 瓶，每小組 1 瓶。無(wú)菌操作 。 無(wú)菌青霉素瓶 15 只；無(wú)菌 1ml 吸管 1 支。 3 Hanks＇液 （母液由技術(shù)室提供） 成分 量 備 注 A液 100 按照 1： 1： 18 比例進(jìn)行配比混勻，總量為2020ml，過(guò)濾除菌，然后按照每瓶 500ml分裝，并注明名稱(chēng)配制日期，每室 4 瓶。 B 液 100 雙蒸水 1800 無(wú)菌 10ml 吸管 2 支， 1000ml 量筒 1 只， 1000ml 大酒精瓶 1 只，無(wú)菌 100ml 鹽水瓶 20 只。 雙抗 成分 量 備 注 青霉素（ 80 萬(wàn) U） 2 瓶 配制雙抗終濃度為： 16000單位 /ml；鏈霉素10000μ g/ml。按 5ml/瓶分裝，瓶口貼好膠布作好標(biāo)記，膠布上注明配制日期和組別。每室 20 瓶。每小組 1 瓶。 4℃ 保存?zhèn)溆谩? 鏈霉素（ 1g) 1 瓶 無(wú)菌 Hank s＇液 100ml 無(wú)菌 5ml 吸管 1 支，無(wú)菌青霉素瓶 20 只。 血清的滅活和分裝 成分 量 備 注 無(wú)菌 小牛 血清 150ml 總量為 150ml， 56℃的水浴鍋中進(jìn)行熱滅活，滅活時(shí)間 30min，后按照每瓶 5ml分裝，并在瓶口處貼好膠布作好標(biāo)記，膠布上寫(xiě)好日期和組別。每實(shí)驗(yàn)室 30 瓶。每小組 2瓶。－ 20℃ 保存?zhèn)溆谩? 無(wú)菌 5ml 吸管 1 支，無(wú)菌青霉素瓶 30 只。 4 1 PBS 配制 成分 量 備 注 NaCl g 總量為 1000ml，每瓶按 70ml分裝，用硫酸紙包好瓶口，待高壓 滅菌后第二天派人再換大翻保存。每實(shí)驗(yàn)室 15 瓶。每小組 1瓶。 KCl Na2HPO412H2O KH2PO4 去離子水 至 1000ml 標(biāo)好 1000ml 刻度的酒精瓶或 1000ml 容量瓶 1 只，無(wú)菌 100ml 鹽水瓶 15 個(gè)。 染色液 成分 量 備 注 結(jié)晶紫 溶解、混勻 ，濾紙過(guò)濾 甲醛 10ml NaCl 無(wú)水乙醇 50ml 去離子水 加至 100ml 250ml 量筒 1 只， 500ml 鹽水瓶 1 只。 分裝 VTP（由技 術(shù)室提供） 成分 量 備 注 無(wú)菌 VTP 70ml 無(wú)菌操作按 4ml/瓶分裝，并注明日期和組別。每實(shí)驗(yàn)室 15 瓶。 無(wú)菌 5ml 吸管 1 支，無(wú)菌青霉素瓶 15 只。 ☆ 未特別說(shuō)明上述試劑均放置 2～ 8℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩? ☆ 每次實(shí)驗(yàn)除菌過(guò)濾的順序：三個(gè)班的 RPMI1640先濾，然后再濾 Hank＇ s 液。 ☆ 每組完成后統(tǒng)一收好，下次再分配到各小組。 備注： 常規(guī)實(shí)驗(yàn)室用品注意更換，包括酒精缸和酒精燈，棉球，一次性臺(tái)布等。 5 實(shí)驗(yàn)二 雞胚原代成纖維細(xì)胞的制備與培養(yǎng) 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 掌握雞胚原代成纖維細(xì)胞的制備及培養(yǎng)的基 本步驟； 掌握活細(xì)胞的顯微鏡下觀察； 熟悉病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖的基本判斷方法。 二、實(shí)驗(yàn)原理 離體動(dòng)物組織通過(guò)溫和的手段（機(jī)械和酶消化）形成單個(gè)細(xì)胞后，在適宜的外界環(huán)境中，包括溫度、酸堿度和氣相環(huán)境，并給予充足合適的營(yíng)養(yǎng)條件，能生存、生長(zhǎng)形成單層細(xì)胞，這種原代培養(yǎng)的細(xì)胞具有原來(lái)體內(nèi)所具備的基本特性，比如肌肉細(xì)胞的收縮功能；上皮細(xì)胞的分泌功能等。通常把這種從體內(nèi)取出組織細(xì)胞開(kāi)始培養(yǎng)到第一次進(jìn)行傳代之前的這一段時(shí)期稱(chēng)為原 (初 )代培養(yǎng)。原代細(xì)胞最接近體內(nèi)細(xì)胞的特性，因而對(duì)外界環(huán)境的變化也最敏感，因此比較適合病毒的增 殖，藥物的作用機(jī)制等的研究。
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