細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件(編輯修改稿)
2025-02-13 20:59 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 注入口 (用于注滿水 )。 水套排水口（在水套注滿過程中或熱脹冷縮時(shí)讓空氣逸出，不能覆蓋）。 ? 水套排氣口（用于迅速排空水套）。 ? 加熱式內(nèi)門（為了保持箱內(nèi)干燥）。 ? 箱內(nèi)氣體取樣口（可使用 Fyrite或類似工具提取箱內(nèi)樣本的含量）。 二氧化碳培養(yǎng)箱的結(jié)構(gòu) 二、技術(shù)方法 ? 1．細(xì)胞分離和原代培養(yǎng) ? 原代培養(yǎng)也叫初代培養(yǎng)，指從供體取得組織，分離得到所需細(xì)胞后接種于培養(yǎng)瓶，進(jìn)行首次培養(yǎng)。 技術(shù)方法 細(xì)胞分離 原代（初代）培養(yǎng) 消化法傳代 組織塊剪切 ,消化法使組織進(jìn)一步分散 制備 獲得細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)后，加入營養(yǎng)液稀釋成一定濃度細(xì)胞懸液孵箱中進(jìn)行培養(yǎng) 細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)后，加入營養(yǎng)液稀釋成一定濃度細(xì)胞懸液孵箱中進(jìn)行培養(yǎng) 將原代細(xì)胞培養(yǎng)物用胰酶和EDTA消化處理后，收集 洗滌，再分裝至 含有新鮮營養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng) （ 1） 細(xì)胞懸液的分離方法 ? 培養(yǎng)材料為血液、羊水、胸水和腹水等細(xì)胞懸液時(shí)，可采用離心法分離。一般用 500～ 1000rpm的低轉(zhuǎn)速，時(shí)間約5～ 10min。如果一次離心樣品量很多，時(shí)間可適當(dāng)延長，但離心速度過大、時(shí)間過長，會擠壓細(xì)胞造成損傷甚至死亡。 (2)組織塊的分離方法 ? 培養(yǎng)材料為組織塊時(shí)，首先要把組織塊剪切至盡量小，然后用消化法使組織進(jìn)一步分散，以獲得細(xì)胞懸液。對細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，如胚胎、上皮、肝、腎等可用胰蛋白酶消化；對于纖維性組織和較硬的上皮組織、癌組織等可使用膠原酶消化。 消化液 ? 胰酶（ Trypsin）： %~%，用 DHanK’S液配制，最佳 pH8~9 ? EDTA ： %，作用于細(xì)胞間連接尤其對貼壁的細(xì)胞適用 ? 膠原酶（ Collagenase）： ~(20萬 u/L)， ， Ca2+， Mg2+不抑制其活性，作用于膠原組織，適用于上皮類原代細(xì)胞。 2．培養(yǎng)細(xì)胞的傳代 ? 細(xì)胞由原培養(yǎng)瓶內(nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶的過程稱之為傳代；進(jìn)行一次分離培養(yǎng)稱之為傳一代。 培養(yǎng)細(xì)胞傳代根據(jù)不同細(xì)胞采取不同的方法。 （ 1）貼壁細(xì)胞的消化傳代 ? 貼壁生長的細(xì)胞多用消化法傳代，傳代中常用到二乙烯四乙酸二鈉（ EDTA）。EDTA能從組織生存環(huán)境中吸取 Ca2+、Mg2+，這些離子是維持組織完整的重要因素。但 EDTA單獨(dú)使用不能使細(xì)胞完全分散，因而常與胰蛋白酶按不同比例混合使用，效果較好。 消化傳代的基本過程是： ? 吸除或倒掉瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液，向瓶內(nèi)加入少量約1～ 2ml消化液（一般含胰蛋白酶、 EDTA），輕輕搖動培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細(xì)胞表面； ? 然后在 37℃ 環(huán)境下孵育 13min，把培養(yǎng)瓶放置顯微鏡下進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后，應(yīng)立即倒掉消化液，加入 Hanks液沖洗一次以終止消化； ? 然后加入少許培養(yǎng)液，用彎頭吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，使之脫落形成細(xì)胞懸液，以 1： 2或 1： 3的比例接種在新的培養(yǎng)瓶內(nèi)。 （ 2）懸浮細(xì)胞的傳代 ? 懸浮生長的細(xì)胞可直接添加新鮮培養(yǎng)液，或離心收集，接種到新培養(yǎng)瓶。 ? 通常在 4~5天需傳代，一般以 1:4稀釋傳代。 3．細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇 ? 培養(yǎng)細(xì)胞在傳代中性質(zhì)易發(fā)生改變 , 有支原體污染的危險(xiǎn)。研究工作也要求細(xì)胞株的代數(shù)應(yīng)維持在一定期限內(nèi)。解決這些困難的方法就是將細(xì)胞凍存，需要的時(shí)候再行復(fù)蘇。細(xì)胞凍存在液氮中，從理論上講貯存時(shí)間是無限的 。 ? 在不加保護(hù)條件下直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水會形成 結(jié)晶 ，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列變化而引起細(xì)胞死亡。 ? 如向培養(yǎng)基中加入 保護(hù)劑 甘油或二甲基亞砜（ DMSO），可使冰點(diǎn)降低，在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外。 ? 溶解細(xì)胞時(shí)，速度要快，使之迅速通過細(xì)胞最易受損的－ 5℃ ～ 0℃ 后，細(xì)胞仍能生長，活力不受任何損害。 ? 細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的原則是 “ 慢凍快融 ” 。 凍存時(shí)選用對數(shù)生長期細(xì)胞，用常規(guī)方法收集細(xì)胞。在液氮中可長期保存 。 ? 凍存細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)，將凍存于液氮中的凍存管取出，迅速放入 37～ 40℃水浴中使其在 1min內(nèi)融化。在無菌條件下打開凍存管，取出細(xì)胞懸液至離心管中，補(bǔ)加 10ml培養(yǎng)液，500～ 1000rpm低速離心 5min，去上清，加入新鮮培養(yǎng)液適量，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中置 37℃ 培養(yǎng)。 4． 細(xì)胞培養(yǎng)微生物污染的檢測 ? 細(xì)胞培養(yǎng)過程中操作不當(dāng)時(shí)，易引發(fā)微生物污染。微生物污染一旦明確，多數(shù)將無法救治。為了防止污染的蔓延，還應(yīng)及時(shí)丟棄污染細(xì)胞。 ? （ 1）霉菌和細(xì)菌污染 霉菌和細(xì)菌繁殖迅速，能在很短的時(shí)間內(nèi)壓制細(xì)胞生長或排出有毒物質(zhì)殺滅細(xì)胞，因此霉菌和細(xì)菌污染較易發(fā)現(xiàn)。 ? 霉菌污染后多在培養(yǎng)液中形成白色或淺黃色飄浮物，一般肉眼可見，較易被發(fā)現(xiàn)，短期內(nèi)培養(yǎng)液多不混濁，倒置顯微鏡下可見于細(xì)胞之間有縱橫交錯(cuò)穿行的絲狀、管狀及樹枝狀菌絲，并懸浮飄蕩在培養(yǎng)液中；很多菌絲在高倍鏡下可見到有鏈狀排列的菌珠；念珠菌或酵母菌形態(tài)呈卵形，散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間生長。 ? 細(xì)菌污染后培養(yǎng)液短期內(nèi)顏色變黃，表明有大量酸性物質(zhì)產(chǎn)生，出現(xiàn)明顯混濁現(xiàn)象；有時(shí)靜置的培養(yǎng)瓶液體初看不混，但稍加震蕩，就有很多混濁物漂起；倒置顯微鏡下觀察，可見培養(yǎng)液中有大量細(xì)小的圓球狀顆粒飄浮，有時(shí)在細(xì)胞表面和周圍有大量細(xì)菌存在，細(xì)胞生長停止并有中毒表現(xiàn) 。 （ 2）支原體污染 ? 支原體污染是一個(gè)常見而又棘手的問題。支原體是一種大小介于細(xì)菌和病毒之間（最小直徑）并獨(dú)立生活的微生物，因此可通過濾菌器，支原體對熱敏感但對一般抗生素不敏感。支原體污
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