細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)ppt課件-資料下載頁
2025-01-17 20:59本頁面
【正文】 淋巴細(xì)胞母細(xì)胞化并聚集 . 三、 應(yīng)用 ? 生物體是一個(gè)高度統(tǒng)一的整體，而細(xì)胞生物學(xué)的主要對(duì)象是生物體內(nèi)的各種細(xì)胞，很顯然，在整體條件下研究單個(gè)細(xì)胞或某一細(xì)胞群在體內(nèi)（ in vivo）的功能活動(dòng)是非常困難的。 細(xì)胞培養(yǎng)的意義 主要在于兩點(diǎn)，其一是人工培養(yǎng)條件易于改變并能嚴(yán)格控制，便于研究各種因素對(duì)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能和各種生命活動(dòng)規(guī)律的影響；其二是細(xì)胞在體外培養(yǎng)環(huán)境中可以長期存活和傳代，可以比較經(jīng)濟(jì)地、大量地提供在同一時(shí)期、條件相同、性狀相似的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)樣本。因此，大量生物醫(yī)學(xué)研究工作依賴于細(xì)胞培養(yǎng)，許多重要的發(fā)現(xiàn)都基于培養(yǎng)細(xì)胞的工作。 ? 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)也存在著一定局限性，主要是細(xì)胞離體以后失去與體內(nèi)環(huán)境的密切聯(lián)系，失去了神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和不同細(xì)胞間的相互作用，特定分化基因的表達(dá)減弱或停止，而進(jìn)化中保守的細(xì)胞生長和增殖活動(dòng)卻可維持，遂使體內(nèi)外細(xì)胞出現(xiàn)了差異，這是應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)該注意的問題。 ? 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)除經(jīng)典地用于細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能和細(xì)胞活動(dòng)研究以外，還成為近年發(fā)展起來的細(xì)胞工程技術(shù)的基礎(chǔ)，也就是說細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)重要應(yīng)用就是各種細(xì)胞工程技術(shù)。因此在此對(duì)這些相關(guān)技術(shù)作一簡介。 ? 一般地， 細(xì)胞工程 指應(yīng)用各種手段對(duì)細(xì)胞不同結(jié)構(gòu)層次 (整體、細(xì)胞器、核、基因等 )進(jìn)行改造，如進(jìn)行細(xì)胞融合、核移植、基因轉(zhuǎn)移等，以獲得具有特定生物學(xué)特性的細(xì)胞。 （一）細(xì)胞融合 ? 在細(xì)胞自然生長情況下，或在其他人為添加因素存在下，使同種細(xì)胞之間或不同種類細(xì)胞之間相互融合的過程，即為細(xì)胞融合（ cell fusion）。通過細(xì)胞融合，可將來源于不同細(xì)胞核的染色體結(jié)合到同一個(gè)核內(nèi)，結(jié)果形成一個(gè)合核體的雜種細(xì)胞。在實(shí)際工作中常采用各種促融合手段，包括病毒類融合劑如仙臺(tái)病毒、化學(xué)融合劑如聚乙二醇（ PEG）及電激融合法等。 ? 在進(jìn)行細(xì)胞融合反應(yīng)和適當(dāng)時(shí)間的培養(yǎng)后，需要通過一定方法對(duì)兩種親本細(xì)胞融合產(chǎn)生的具有增殖能力的雜種細(xì)胞進(jìn)行篩選。篩選方法主要包括藥物抗性篩選、營養(yǎng)缺陷篩選和溫度敏感性篩選等。 ? 細(xì)胞融合最典型的應(yīng)用是單克隆抗體技術(shù)。1975年 Koehler和 Milstein將用綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞和體外培養(yǎng)能長期繁殖的小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，獲得了具有兩種親本細(xì)胞特性的雜交細(xì)胞，即既能在培養(yǎng)條件下長期生長增殖，又能分泌特異的抗綿羊紅細(xì)胞的抗體的 B淋巴細(xì)胞雜交瘤。細(xì)胞融合技術(shù)的發(fā)展和骨髓瘤細(xì)胞株的建成促成了 B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)的建立和單克隆抗體技術(shù)的成功。 （二）核移植 ? 細(xì)胞核移植 （ nuclear transfer）是指將一個(gè)雙倍體的細(xì)胞核（可來自胚胎細(xì)胞或體細(xì)胞）移植到去核的成熟卵母細(xì)胞或受精卵中。重組的卵細(xì)胞可以植入母體，并能發(fā)育為與供核細(xì)胞基因型相同的后代，因此又稱為動(dòng)物克隆技術(shù)。 1997年誕生的克隆羊 “ 多利 ” 就是體細(xì)胞核移植技術(shù)的產(chǎn)物。 ? 核移植技術(shù)首先是選取合適的受體去核卵細(xì)胞和供體核。目前均以發(fā)育至減數(shù)分裂中期 II的成熟卵母細(xì)胞為受體，供體核則可以采用胚胎細(xì)胞、未分化的原始生殖細(xì)胞、胎兒細(xì)胞乃至高度分化的成年動(dòng)物細(xì)胞。核質(zhì)融合一般是將獲得的核轉(zhuǎn)移到已經(jīng)人工去核的成熟卵母細(xì)胞卵周隙后，施加微電流脈沖，使核質(zhì)融合，形成一個(gè)重組卵。重組卵需經(jīng)一定時(shí)間的體外培養(yǎng)，或放入中間受體動(dòng)物輸卵管內(nèi)孵育，經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)，有的動(dòng)物需形成桑椹胚或囊胚，再植入受體子宮里。 （三） 基因轉(zhuǎn)移（ gene transfer） ? 基因轉(zhuǎn)移指向受體細(xì)胞中導(dǎo)入外源基因，是改造細(xì)胞遺傳性狀的常用手段。一般情況下，能穩(wěn)定接納外源基因的細(xì)胞也只有受體細(xì)胞總數(shù)的千分之幾。因此為了快速有效地篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，一般在轉(zhuǎn)入基因中攜帶有特定的選擇標(biāo)記，目前應(yīng)用較多的為細(xì)胞抗藥性篩選，如根據(jù)新霉素抗性基因進(jìn)行篩選。 ? 基因轉(zhuǎn)移又常稱為基因轉(zhuǎn)染（ gene transfection）。 ? 基因轉(zhuǎn)移的方法可分為物理學(xué)、化學(xué)和生物學(xué)三類。 ? 1． 物理學(xué)方法包括電穿孔、顯微注射、裸露 DNA直接注射。 ? 2．化學(xué)方法包括 DEAE－葡聚糖、磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)體法等，其原理是通過改變細(xì)胞膜的通透性或者增加 DNA與細(xì)胞的吸附而實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移的。這些方法多用于培養(yǎng)細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移。 ? 3．生物學(xué)方法主要指病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。目前常用的病毒載體包括 DNA病毒載體（腺病毒載體、猴腫瘤病毒載體、牛痘病毒載體）、反轉(zhuǎn)錄病毒載體等。用作基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的病毒載體都是缺陷型的病毒，感染細(xì)胞后僅能將基因組轉(zhuǎn)入細(xì)胞，無法產(chǎn)生包裝的病毒顆粒。 （四）細(xì)胞治療與組織工程 ? 細(xì)胞治療是指用體外培養(yǎng)的正常細(xì)胞，或者是導(dǎo)入外源基因的細(xì)胞，或者是利用由干細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來的特定細(xì)胞，植入患者病變部位以代償病變細(xì)胞喪失的功能。例如血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療時(shí)，通過放療徹底殺滅腫瘤細(xì)胞，同時(shí)摧毀患者的造血系統(tǒng)，然后移植健康供者的骨髓，即人們常說的骨髓移植，就是最常見的細(xì)胞治療。 ? 人胚胎干細(xì)胞的建系為細(xì)胞治療提供了更大的可能性。在利用胚胎干細(xì)胞作細(xì)胞治療時(shí)，首先要考慮克服異體移植中的免疫排斥反應(yīng)，其方法是將人胚胎干細(xì)胞進(jìn)行MHC基因操作，建立可供移植對(duì)象配對(duì)選擇的各種 MHC組合的胚胎干細(xì)胞庫。 ? 在這基礎(chǔ)上，根據(jù)不同的移植對(duì)象和要求，或直接定向誘導(dǎo)分化為功能性細(xì)胞（如神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等）；或定向誘導(dǎo)分化為組織干細(xì)胞（如造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等），這類組織干細(xì)胞也可直接取材于成體組織或器官，最終植入患者病變部位。 ? 另一種途徑是將患者的體細(xì)胞核導(dǎo)入去核卵細(xì)胞或去核胚胎干細(xì)胞，體外發(fā)育至一定階段后，從中分離培養(yǎng)出供核患者專用的胚胎干細(xì)胞，再經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生所需的分化類型的細(xì)胞，回輸至供核患者，同樣也避免了免疫排斥問題。 ?組織和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 主編章靜波 思考題 ? . ? . ?
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