細胞培養(yǎng)技術入門-資料下載頁
2024-11-11 05:45本頁面
【導讀】毒過的物品）、包裝臺。必須放在無菌間的設備：離心機、超凈工作臺、倒置顯微鏡、CO2孵箱、水浴鍋、三氧消毒殺菌機、4℃冰箱。潔爾滅或者％過氧乙酸擦拭。：用75％酒精擦拭超凈臺、邊臺、倒置顯微鏡的載物臺。75％酒精棉球擦凈雙手。，動作要輕、準確，不能亂碰。，防止交叉污染。、泡鹽酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀鹽酸中12小時以除去臟物、鉛、砷等物。閥，當指針指向15磅時，維持20-30分鐘。注意在超凈臺內取出使用時應該立即將螺旋旋緊。為了防止清洗器材已。檢查安全閥是否通暢，以防高壓時爆炸。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補充蒸發(fā)掉的水份。胰蛋白酶的作用是使細胞間的蛋白質水解從而使細胞離散。不同的組織或者細胞對胰酶的作用反應不一樣。使用胰酶時，應把握好濃度、溫度和時間，以免消化過度造成細胞損傷?；瘯r，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對細胞的作用。
【正文】 盤天平平衡后，放入離心機中 3000r/min 離心 3min 五 .制備細胞懸液： 。 10ml培養(yǎng)液，吹打制成細胞懸液。 六 .細胞計數： 細胞濃度以 5105/ml 為宜。 七 .培養(yǎng)細胞 將復合細胞計數要求的細 胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內，將培養(yǎng)瓶放入 37℃ 和 5％ CO2 的培養(yǎng)箱內 24 小時（或者 2448 小時）后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時間由細胞情況而定。 初學者易犯錯誤： 1 水浴鍋未預熱或者未預熱到 37℃ 。 ，導致傳熱不佳，使融化時間延長。 ，導致離心機損壞和細胞丟失。 ，忘記更換吸頭和吸管，導致細胞交叉污染。 細胞計數 實驗原理：當待測細胞懸液中細胞均勻分布時，通過測定一定體積懸液中的細胞的數目，即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數目。 具體操作： 一 .準 備工作： 取一瓶傳代的細胞，按照《傳代細胞培養(yǎng)（消化法）》中的傳代方法繁殖細胞，待長成單層后以被使用。 二 .細胞懸液制備： 細胞懸液的制備方法是用 ％的胰蛋白酶液消化、 PBS 液洗滌后，加入培養(yǎng)液（或 Hanks 液或 PBS 等平衡鹽溶液），吹打制成待測細胞懸液。 三 .細胞計數： ：取一套血球計數板，將特制的蓋玻片蓋在血球計數槽上。 ：用吸管吸 5 滴細胞懸液到一離心管中，加入 5 滴臺盼藍染液（ ％）或苯胺黑，活細胞不會被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細胞和死細胞。 ：將待測細胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。 ：將血球計數板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動計數板，當看到鏡中出現計數方格后，數出四角的四個大鉻（每個大格含有 16 個中鉻）中沒有被染液染上色的細胞數目。 :按照下面公式計算細胞密度： （細胞懸液的細胞數） /ml＝ （ 四個大格子細胞數 /4) 2104 說明：公式中除以 4 因為計數了 4 個大格的細胞數。 公式中乘以 2 因為細胞懸液于染液是 1： 1 稀釋。 公式中乘以 104 因為計數板中每一個大格的體積為： （長） （寬） （高）＝ 而 1ml＝ 1000mm3 四 .細胞計數要點： ，要求懸液中細胞數目不低于 104 個 /ml，如果細胞數目很少要進行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中； ，否則影響計數準確性。 ，應充分混勻細胞懸液，尤其時多次取樣計數時更要注意每次取樣都要混勻，以求計數準確； 4. 數細胞的原則是只數完整的細胞 ，若細胞聚集成團時，只按照一個細胞計算。如果細胞壓在格線上時，則只計上線，不計下線，只計右線，不計左線。 5. 操作時，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中，否則要重新計數。 五 .初學者易犯的錯誤： 1. 計數前未將待測懸液吹打均勻。 2. 滴入細胞懸液時蓋玻片下出現氣泡。 3. 滴入懸液時的量太多，至使細胞懸液流入旁邊的槽中。 六 .本實驗特殊試劑的配制： 4％臺盼藍母液：稱取 4 克臺盼藍，加入少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至 100毫升，用濾紙過濾， 4℃ 保存。 使用液：使用時，用 PBS 稀釋母液至 ％即 可。 細胞的凍存 4℃ 冰箱，約 40min。 20℃ 冰箱，約 3060min。 80 超低溫冰箱中放置過夜。 。 5 同時做好凍存記錄，在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄。 注意事項： DMSO 前，不需要進行高壓滅菌，它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌反而會破華它的分子結構，以至于降低冷凍保護效果。在常溫下， DMSO 對人體有害，故在配制時最好戴上手套操作。 0℃ ～ 60℃ 這一溫度范圍內過久，低溫損傷主要發(fā)生在這一溫度區(qū) 內，是 “ 危險溫區(qū) ” 。 ，及時添加。
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