細胞培養(yǎng)相關(guān)技術(shù)ppt課件-資料下載頁
2025-05-03 03:43本頁面
【正文】 特異性高，非特異性熒光染色少。缺點是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。 ? 間接法：特異性的一抗和熒光素標(biāo)記的二抗 Factin直接染色 ? 中文名稱： 鬼筆環(huán)肽 ? 英文名稱： phalloidin ? 定義： 由鬼筆鵝膏真菌（ Amanita phalloides）產(chǎn)生的一種環(huán)肽。可與 F肌動蛋白結(jié)合，使 F肌動蛋白保持穩(wěn)定。其熒光標(biāo)記物是鑒定 F肌動蛋白的重要試劑。 GFP TRITCphalloidin DAPI 58,60,61 62,64,65 80,81,82 間接免疫熒光染色 ? 制片 ? 細胞接種 ? 固定 ? 破膜 ? 封閉 ? 染色 ? 封片和熒光顯微鏡觀察 制片 ? Chamber slide：腔室玻璃系統(tǒng) ? Coverslip：蓋玻片（酒精，紫外照射滅菌） ? 玻片包被：膠原，纖維蛋白 fibronectin，整合素intergrin， vitronectin… *有些基質(zhì)蛋白是與細胞內(nèi)某些信號通路相關(guān)的 Chamber slide 細胞接種 ? 根據(jù)不同的研究內(nèi)容和實驗?zāi)康模x擇不同細胞密度進行接種和生長時間 ? 染色前用溫?zé)岬?PBS洗去培養(yǎng)基（含 Ca2+、 Mg2+ 或者不含 Ca2+、 Mg2+的 PBS的選擇） 固定 ? 根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭毎?，?4% 多聚甲醛 固定 15分鐘 ? 多聚甲醛宜現(xiàn)用現(xiàn)配，或配好后分裝 20 ℃ 凍存，用之前 37 ℃ 復(fù)溫 ? 固定完畢后的細胞可置于含疊氮納的 PBS中 4℃ 保存 3個月 ? PBS洗滌 3 5 min 破膜或通透 ? 在檢測細胞內(nèi)抗原表位的時候需要對細胞進行通透處理，因為抗體需要進入細胞內(nèi)部去檢測蛋白 ? 如果待檢測的是跨膜蛋白，且其抗原表位處于胞質(zhì)內(nèi)區(qū)域，則同樣需要對細胞進行通透 ? 如果所檢測的抗原表位位于膜蛋白的胞外段，則不需要進行通透。 ? 常用的通透劑是去垢劑，如 Triton ， NP40，以及 Tween 20，Saponin， Digitonin 和 Leucoperm等。 ? Triton和 NP40屬于烈性去垢劑，可部分溶解細胞核膜，因此非常適合核抗原檢測。但應(yīng)該注意的是，如果在高濃度下使用或者作用時間過長，它們將破壞蛋白，從而影響實驗結(jié)果。 Triton X100是最常用的通透劑，但是它將破壞細胞膜，因此不適用于細胞膜相關(guān)抗原。 ? 后面一組去垢劑要溫和得多，它們可以在細胞質(zhì)膜上形成足夠大的孔隙以允許抗體通過，但是不會溶解細胞質(zhì)膜。適于胞質(zhì)抗原或者質(zhì)膜上靠近胞質(zhì)一面的抗原，也適于可溶性的核抗原。 封閉 ? PBST + 1% BSA，室溫， 1h 抗體孵育 ? 為保證結(jié)合質(zhì)量和防止干燥，抗體孵育應(yīng)盡量在濕盒中進行。 ? 二抗是熒光抗體，因此孵育時注意避光 ? 一抗室溫孵育 1h， PBST洗滌 3 5mim ? 二抗室溫孵育 1h， PBST洗滌 3 5mim ? 核染：可在 PBST第二次洗滌時在 PBST中加入核染料如DAPI（ 儲存液用蒸餾水配成 1mg/ml的濃度，使用終濃度一般為 ~1μg/ml ） 封片及熒光觀察 ? 為了保存結(jié)果，以便進一步觀察、照像、統(tǒng)計分析等，需作封片（ mounting）處理 ? 常規(guī)的方法是采用甘油或中性樹脂封片，為了增強封片的效果，往往需要在封片時添加特殊的抗熒光淬滅劑 ? 商業(yè)化的 Mounting buffer有的已含有 DAPI，染核在封片時即完成 抗體選擇 ? GFP + TRITC目標(biāo)蛋白 +DAPI ? FITC目標(biāo)蛋白 1+TRITC目標(biāo)蛋白 2+DAPI，應(yīng)注意目標(biāo)蛋白 1和 2的熒光標(biāo)記偶聯(lián) 2抗的匹配 GFP Mouse βcatenin DAPI Mouse βcatenin Rabbit ECSM2 DAPI
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