【正文】 數(shù)分鐘，于倒立顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時(shí)，吸掉 trypsinEDTA 溶液。Adenocarcinoma 解凍后須較高之濃度，而 HeLa 只需 13 x 106cells/ml。 將新鮮培養(yǎng)基置于 37 176。 C 水槽中回溫， 回溫后噴以 70 % 酒精并擦拭之， 移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。 附 細(xì)胞計(jì)數(shù)與存活測(cè)試（一） 1. 原理： . 計(jì)算細(xì)胞數(shù)目可用血球計(jì)數(shù)盤或是 Coulter counter 粒子計(jì)數(shù)器自動(dòng)計(jì)數(shù)。 3 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基？ 不能。分瓶時(shí)取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶， 加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度， 重復(fù)前述步驟即可。*20 176。 C 冰箱中， 顏色會(huì)偏暗紅色， 且 pH值會(huì)越來(lái)越偏堿性？ 培養(yǎng)基保存于 4 176。 27 收到之冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落之原因？ 冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因?yàn)椴僮髡邐A取冷凍管時(shí)用力不當(dāng)，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。 34二價(jià)離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時(shí)加入EDTA的目的是什么？ 二價(jià)離子的確抑制胰蛋白酶活性。胰蛋白酶在 4℃ 就可能開始降解，如果在室溫下放置超過 30分鐘，就會(huì)變得不穩(wěn)定。 培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀， 同時(shí) pH 發(fā)生變化 細(xì)菌或真菌污染 丟棄培養(yǎng)物。 原代細(xì)胞培養(yǎng)物污染 原代培養(yǎng)組織在進(jìn)入培養(yǎng)前已污染 培養(yǎng)前用含高濃度抗生素的平衡鹽溶液反復(fù)沖洗組織。 換入新鮮配制培養(yǎng)液。但必須注意的是，融解過程中必須規(guī)則地?fù)u晃均勻。 請(qǐng)勿將血清置于 37℃ 太久。這應(yīng)該不會(huì)影響血清的質(zhì)量。 血清 （ 1） 1. 保存血清最好的方法 ? 建議血清應(yīng)保存在 5℃ 至 2O℃ 。試劑保存不當(dāng)。 用無(wú)鈣鎂平衡鹽溶液洗滌細(xì)胞，輕輕吹吸細(xì)胞獲得單細(xì)胞懸液。 培養(yǎng)液出現(xiàn)沉淀，但 pH值不變 用洗滌劑清洗后殘留磷酸鹽將培養(yǎng)基成分沉淀下來(lái)。 36 一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時(shí)，您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，（特別是雌激素）。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，必須確認(rèn)細(xì)胞為mycoplasmafree，實(shí)驗(yàn)結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。 C 16~18 小時(shí) (或隔夜 ) → 液氮槽 vaporphase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。 9 附著性細(xì)胞繼代時(shí)所使用之 trypsinEDTA 濃度？應(yīng)如何處理？ 一般使用之 trypsinEDTA 濃度為 % Na。 活細(xì)胞數(shù) /方格： 55 ,62, 49, 59 死細(xì)胞數(shù) /方格： 5, 3, 4, 6 細(xì)胞總數(shù) = 243 平均細(xì)胞數(shù) /方格 = 稀釋倍數(shù) = 2 細(xì)胞數(shù) /ml： x 104 x 2 = x 106 細(xì)胞數(shù) /flask： x 106 x 10ml = x 106 存活率： 225/243﹦ % 升級(jí)篇 細(xì)胞培養(yǎng) 1 1 冷凍管應(yīng)如何解凍？ 取出冷凍管后， 須立即放入 37 176。 2. 將原封之 T25 flask 靜置于 37 176。 2. 冷凍細(xì)胞解凍程序 : . 依據(jù)細(xì)胞株數(shù)據(jù)單指定之基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類、血清種類和其它指定之成份和比例，制備培養(yǎng)基。程序?yàn)?: program 7: HB CELL 基礎(chǔ)篇 冷凍細(xì)胞活化 1. 冷凍細(xì)胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結(jié)晶而對(duì)細(xì)胞造成傷害，導(dǎo)致細(xì)胞之死亡。 Glycerol 亦應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí)，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。訂購(gòu)多量同一批號(hào)的優(yōu)良血清，置于 –70℃ 保存之 基礎(chǔ)篇 細(xì)胞傳代培養(yǎng) 1. 細(xì)胞生長(zhǎng)至高密度時(shí)，即須分殖至新的培養(yǎng)瓶中，一般稀釋比例為 1:3 至 1:6，依細(xì)胞種類而異。若欲減少這些凝絮沈淀物，可用離心3000 rpm, 5 min 去除，或離心后上清液可以加入培養(yǎng)基中一起過濾。 3. 若要檢測(cè) mycoplasma，則培養(yǎng)基內(nèi)不可添加gentamicin，因 gentamicin 會(huì)抑制 mycoplasma 生長(zhǎng)。 . 將溶解且含飽和 CO2 之 NaHCO3 溶液加入溶解之液體培養(yǎng)基中混合。 基礎(chǔ)篇 實(shí)驗(yàn)用品 1. 種類 ︰ . 細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用品均為無(wú)菌，除了玻璃容器與 pasteur pipet 外，其它均為塑料無(wú)菌制品。每次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。 5. 定期檢測(cè)下列項(xiàng)目： . CO2 鋼瓶之 CO2 壓力 . CO2 培養(yǎng)箱之 CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染 (水盤的水用無(wú)菌水，每周更換 )。因此粉末培養(yǎng)基及 NaHCO3 粉末應(yīng)分別溶解后才混合，然后用 CO2 氣體調(diào)整 pH，而非用強(qiáng)酸 (HCl)或強(qiáng)堿 (NaOH)，因?yàn)槁入x子對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)可能有影響，且貯存時(shí)培養(yǎng)基的 pH 易發(fā)生改變。 基礎(chǔ)篇 抗生素 1. 細(xì)胞庫(kù)之細(xì)胞培養(yǎng)基不加抗生素 . 培養(yǎng)自 ATCC 引進(jìn)之細(xì)胞株，培養(yǎng)基中不加抗生素。補(bǔ)體參與之反應(yīng)有： cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and platelets, enhanced phagocytosis, chemotaxis and activation of lymphocytic and macrophage cell type。 7. 加入 1 ml 10 % Giemsa solution，室溫下靜置染色 23 min。 . 冷凍前檢測(cè)細(xì)胞是否仍保有其特有性質(zhì)，例如 hybridoma 應(yīng)在冷凍保存前一至二日測(cè)試是否有抗體之產(chǎn)生。 . 離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細(xì)胞濃度為 15 x 106 cells/ml，混合均勻，分裝于已標(biāo)示完全之冷凍保存管中， 1 ml/vial，并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測(cè)。 基礎(chǔ)篇 收到細(xì)胞的處理方式 (一 ) 1. 收到細(xì)胞株包裹時(shí)， 請(qǐng)檢查細(xì)胞株冷凍管是否有解凍情形， 若有請(qǐng)立即通知。 C， 5 % CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。若細(xì)胞位于線上，只計(jì)上線與右線之細(xì)胞 (或計(jì)下線與左線之細(xì)胞 )。當(dāng)培養(yǎng)基中 NaHCO3 含量為每公升 g 時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用 10 % CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中 NaHCO3 為每公升 g 時(shí)， 則應(yīng)使用 5 % CO2 培養(yǎng)細(xì)胞。 15 冷凍保存細(xì)胞之方法？ 冷凍保存方法一 : 冷凍管置于 4 176。 19 支原體 (mycoplasma) 污染的細(xì)胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？ 不能。血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放 L谷氨酰胺供利用。 升級(jí)篇 細(xì)胞培養(yǎng) 8 35 當(dāng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中添加抗生素時(shí)，降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的 50%。 加 HEPES 緩沖液至 10 到 25mM 終濃度。 懸浮細(xì)胞成簇 培養(yǎng)液中含鈣、鎂離子。 換入新鮮培養(yǎng)液 培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)減慢 由于更換不同培養(yǎng)液或血清。 分離培養(yǎng)物，檢測(cè)支原體。經(jīng)此處理過的血清對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)只有微小的促進(jìn)，或完全沒有任何作用，甚至通常因?yàn)楦邷靥幚碛绊懥搜宓馁|(zhì)量，而造成細(xì)胞生長(zhǎng)速率的降低。 若必須做血清的熱滅活，請(qǐng)遵守 56℃ ， 30分鐘的原則，并且隨時(shí)搖晃均勻。若欲去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝至無(wú)菌離心管內(nèi)，以 400g稍微離心 ,上清液即可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾。或用抗生素除菌。細(xì)胞凍存或復(fù)蘇過程中損傷。支原體污染。 NaHCO3 緩沖系統(tǒng)緩沖力不足。 33 目錄上說(shuō)， Hank‘s 平衡鹽溶液 (HBS)要在空氣中使用，不需要 CO2培養(yǎng)箱?？傊?，首選 MEM做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、 RPMI1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是一個(gè)好的開始，各種目的無(wú)血清培養(yǎng)最好首選 AIM V（ 12022）培養(yǎng)基（ SFM）。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果， 將造成細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或死亡。 升級(jí)篇 細(xì)胞培養(yǎng) 4 16 細(xì)胞欲冷凍保存時(shí)， 細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？ 冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為 1x106 cells/ml vial， 融合瘤細(xì)胞則以 5x106 cells/ml vial 為宜。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)之一重要原因。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源， 所以血清的種類和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生極大的影響。使用時(shí)，計(jì)數(shù)每個(gè)大正方形內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以 104，即為每 ml 中之細(xì)胞數(shù)目。輕搖冷凍管使其在 1 分鐘內(nèi)全部融化后， 以 70 % ethanol 擦拭冷凍管外部， 移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。 C 水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在 1 分鐘內(nèi)全部融化，以 70 % ethanol 擦拭保存管外部，移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。 . 冷凍方法： . 傳統(tǒng)方法 : 4℃ 10 分鐘 20℃ 30 分鐘 80℃ 16 18 小時(shí) (或隔夜 ) 液氮槽 vapor phase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。 . 懸浮型細(xì)胞 (suspension cell) . 吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，放入離心管中，離心1000 rpm 5 分鐘。以不加血清之 aMEM 稀釋細(xì)胞濃度為 1 102活細(xì)胞數(shù) / ml。在溶解過程中須規(guī)則搖晃均勻 (小心勿造成氣泡 )，使溫度與成分均一，減少沈淀的發(fā)生。 2. 接種 5