【正文】 夠大，以致完全排阻于凝膠 顆粒之外，此時洗脫體積就等于外水體積。即 VR＝ V0，則 K＝ 0。 在通常的工作范圍內(nèi)，對一切溶質(zhì)來說， K 是一個常數(shù) (0≤K≤1)。 第四節(jié) 尺寸排阻色譜法 分子排阻色譜的洗脫順序 ＝ V0,完全不能進凝膠顆粒內(nèi)部的物質(zhì) ＝ V0+Vi，能自由進出顆粒內(nèi)部的物質(zhì) ＞ V0+Vi，具有特殊吸附作用的物質(zhì) 第四節(jié) 尺寸排阻色譜法 ? 二、凝膠的分類 (一 ) 葡聚糖凝膠是常用凝膠，由葡 聚糖和交聯(lián)劑甘油通過醚橋 (－ O－ CH2－ CHOH－ CH2 － O－ )相互交聯(lián)而形成的 多孔性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) OOHOO HO HC H2OOHOHO HO HC H2OOHOHO HOC H2OOHOHO HO HC H2C HC H2C H2O HOOO HOHC H2OOOHOHO HO HC H2C H2C HC H2O HO HC H4第四節(jié) 尺寸排阻色譜法 (二 ) 聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺與 N， N′－亞甲 基－二丙烯酰胺交聯(lián)聚合而成。 C H2C H C H2C H C H2CHCN H2CN HC H2N HCC H CH C H2C H2C H2C HCN H2CN H2O OOO OCN H2O第四節(jié) 尺寸排阻色譜法 (三 )瓊脂糖凝膠 (四 ) (五 )葡聚糖凝膠 LH20 (六 ) 有多孔性硅膠和多孔性玻璃 第四節(jié) 尺寸排阻色譜法 ? (一 ) 分子排阻色譜法對所用凝膠有下列基本要求： 化學性質(zhì)惰性，不與溶質(zhì)發(fā)生任何作用，可以反復(fù) 使用而不改變其色譜性質(zhì)；盡可能不帶電荷以防止 發(fā)生離子交換作用；顆粒大小均勻，機械強度盡可 除以上基本要求外，可根據(jù)分離對象和分離要求選 1. 組別分離 即從小分子物質(zhì) (K＝ 1)中分離大分子物質(zhì) (K＝ 0)或 從大分子物質(zhì)中分離小分子物質(zhì)，即對于分配系數(shù)有顯 著差別的分離叫組別分離。 2．分級分離 當被分離物質(zhì)之間分子量比較接近時，根據(jù)其分配 系數(shù)的分布和凝膠的工作范圍，把某一分子量范圍內(nèi)的 組分分離開來，這種分離稱之為分級分離。 3. 親脂性有機化合物的分離 可選用親脂性凝膠，如黃酮、蒽醌、色素等的分離 可選用葡聚糖凝膠 LH20 第四節(jié) 尺寸排阻色譜法 (二 ) 將所需的干凝膠浸入相當于其吸水量 10倍的溶劑 中，緩慢攪拌使其分散在溶液中，防止結(jié)塊。溶脹時間 依交聯(lián)度而定，交聯(lián)度小的吸水量大，需要時間長，也 可加熱溶脹。 所制備的凝膠勻漿不宜過稀，否則裝柱時易造成大 顆粒下沉，小顆粒上浮，致使填充不均勻。 在分子排阻色譜中，影響分離度的柱參數(shù)中最重要 的是柱長度、顆粒直徑及填充的均勻性。 裝柱填充時不應(yīng)有氣泡，填充后用同一種洗脫劑以 2～ 3倍總體積使柱平衡。 第四節(jié) 尺寸排阻色譜法 (三 ) 一般要求洗脫劑應(yīng)與浸泡溶脹凝膠所用的溶劑 相同，因為如果換溶劑，凝膠體積會發(fā)生變化，從 而影響分離效果。 除非含有較強吸附的溶質(zhì)，一般洗脫劑用量也 僅需一個柱體積。 (四 ) 大分子物質(zhì)分子量的測定是分子排阻色譜法的 重要應(yīng)用之一，特別是蛋白質(zhì)的分子量。 第五節(jié) 聚酰胺色譜法 是由酰胺聚合而成的一類高分子化合物。既 可裝柱又可制成薄膜。 聚己內(nèi)酰胺的結(jié)構(gòu)可用下式表示： 錦綸 6和綿綸 66是兩種最為常用的色譜用聚酰 胺，它們的親水親脂性能都好，是當前一種既能分離極 性物質(zhì)，又能分離非極性物質(zhì)應(yīng)用廣泛的色譜材料。 C H 2C H 2C H 2C H 2C H 2CNOH n第五節(jié) 聚酰胺色譜法 ? (一 ) 聚酰胺分子內(nèi)有許多酰胺鍵，可與酚類、酸 類、醌類、硝基化合物形成氫鍵，因而對這些物質(zhì) 產(chǎn)生了吸附作用。 吸附能力的大小與形成氫鍵能力的強弱有關(guān)。 第五節(jié) 聚酰胺色譜法 聚酰胺吸附作用 第五節(jié) 聚酰胺色譜法 形成氫鍵的能力與溶劑有關(guān)，在水中形成氫鍵 的能力最強，在有機溶劑中較弱，在堿性溶液中最 弱，在水溶劑系統(tǒng)中各種化合物與聚酰胺形成氫鍵 (1) 形成氫鍵的基團數(shù)越多，吸附力越強，如： ＞ ＞O HO HO H O HO HO H第五節(jié) 聚酰胺色譜法 (2) 形成氫鍵的能力與形成氫鍵的基團的位置有 關(guān)，例如間位、對位酚羥基使吸附力增大，鄰位 使吸附力減小。 ＞O H O HO H＞O HO HO H第五節(jié) 聚酰胺色譜法 (3) 芳香核、共軛雙鍵越多，吸附力越大。 (4) 分子內(nèi)氫鍵的形成使化合物吸附力減小。 H O＞ ＞O H O H＞H O O HC OOHO H(二 ) 聚酰胺分子中既有親水基團又有親脂基團，當用極 性溶劑 (如含水溶劑 )作流動相時，聚酰胺中的烷基作為 非極性固定相，其色譜行為類似于反相分配色譜，因黃 酮類苷的極性大于苷元，所以黃酮苷比苷元容易洗脫； 當用非極性流動相 (如氯仿 甲醇 )時，聚酰胺則作為極性 固定相，其色譜行為類似于正相分配色譜。黃酮苷元的 極性小于黃酮苷，因而黃酮苷易被洗脫。此即是聚酰胺 ? 雙重層析只適用于難與聚酰胺形成氫鍵或形成氫鍵 能力弱的化合物 。 第五節(jié) 聚酰胺色譜法 ? (一 ) 聚酰胺薄膜是將錦綸在滌綸片基或玻璃片上涂 聚酰胺薄層色譜廣泛應(yīng)用于 酚性成分 ，包括黃 酮、香豆素以及氨基酸衍生物的分離。 第五節(jié) 聚酰胺色譜法 (二 ) 1. 裝柱 將聚酰胺顆粒研磨成小于 100目的細粉，并預(yù)先 將聚酰胺粉混懸于溶劑 (常用水 )中濕法裝柱。 聚酰胺的樣品容量較大。每 100mL聚酰胺粉可 上樣 ～ 。若利用聚酰胺除去鞣質(zhì)，樣品上柱量 可大大增加。 3. 洗脫 聚酰胺色譜的洗脫劑常用水、由稀至濃的乙醇 液 (10%、 30%、 50%、 70%、 95%)，或氯仿、氯仿 甲 醇 (19︰ 1 、 10︰ 5︰ 2︰ 1︰ 1)，依次洗脫。 第五節(jié) 聚酰胺色譜法 聚酰胺色譜是分離 黃酮類 及 某些酚類 最有效的 方法。用柱色譜可將植物粗提物中的黃酮與非黃 酮、黃酮苷元與苷分開。 聚酰胺對 鞣質(zhì) 的吸附特別強，高分子鞣質(zhì)對聚 酰胺的吸附是不可逆的，因此可利用聚酰胺將植物 粗提物中的鞣質(zhì)除去。