【正文】 色譜柱的基質(zhì)材料 – 硅膠與聚合物 – 現(xiàn)代高效液相色譜填料的特征 ? 色譜柱結(jié)構(gòu) ? 固定相 – 鍵合相 – 色譜柱接頭 – 鍵合相穩(wěn)定性 119 硅 膠 基質(zhì)材料 1. 目前應(yīng)用最為廣泛的基質(zhì)材料。 2. 高機械強度和高的比表面積。 3. 可利用直接的廣泛的表面鍵合反應(yīng)來滿足正相、反相、離子交換、疏水作用色譜和體積排除色譜的需求。 4. 高效。 5. 重現(xiàn)性好。 6. pH 適用范圍為 pH 2－ 8。 7. 具有容易導(dǎo)致強堿性物質(zhì)拖尾的，表面活性和帶酸性的硅羥基。 120 聚合物 基質(zhì)材料 1. 交聯(lián)苯乙烯、二乙烯基苯和甲基苯烯酸酯。 2. pH 穩(wěn)定性好： pH 1－ 13。 3. 可以在很寬的范圍內(nèi)進行表面化學(xué)處理以滿足反相色譜、離子交換色譜、疏水作用色譜和體積排阻色譜的需求。 4. 在中等 pH 條件下對強堿性物質(zhì)具有更好的峰形。 5. 填料的體積隨著流動相的不同而改變，如膨脹或收縮。 6. 分離效率相對硅膠而言比較低 7. 重現(xiàn)性不好 121 硅 膠 外 形 球形硅膠 : ? 現(xiàn)代 HPLC 填料 ? 粒徑小 (5 181。m, 3 181。m, 2 181。m) ? 重現(xiàn)性好 ? 穩(wěn)定性好 ? 分離效率高 無定型硅膠 : ? 最初的 HPLC 填料 ? 粒徑 5 181。m ? 柱床穩(wěn)定性差 ? 比表面積較小 ? 價格便宜 122 硅 膠 純 度 ? 硅膠純度對強極性化合物的分離最重要。 ? 以前的純度較低的硅膠（稱為 A 型硅膠） , A 型硅膠是以金屬硅酸鹽制備而來，具有很高的金屬含量，可被用作中性化合物和非離子化合物的分離。 ? 純度高、酸性較弱的硅膠 (稱為 B 型硅膠 )，這種硅膠是以無金屬的工藝制備而來，只含有微量的金屬，建議用于分離離子化合物和可電離的化合物，特別是堿性化合物。 ? 金屬雜質(zhì)引起對螯合劑和堿性化合物的分離產(chǎn)生不對稱峰或拖尾峰。 123 硅膠純度 M+ 表面金屬能與螯合化合物絡(luò)合 M Si OH 內(nèi)部的金屬對表面硅羥基具有活化作用 強酸性 A 型硅膠 C18 B 型硅膠 C18 124 硅膠孔徑 孔徑 作用和效能 60 nm 對 HPLC 分析沒有用，會引起峰形拖尾和較低的分 離效率 60 – 150 nm 對小分子的分離效果理想 (MW 4,000 to 130,000), 例如藥物分子、傳統(tǒng)的中藥和小分子的縮氨酸 300 – 1,000 nm 對大分子的分離效果理想，如多肽、核苷和高分子 1,000 nm 對聚合物的分離效果理想，如 DNA和生物大分子 125 硅 膠 粒 徑 粒 徑 作 用 和 效 能 5 181。m 目前應(yīng)用最廣泛，可以滿足從分析到半制備的分離 3 – 181。m 常用于分析柱上的快速分離，色譜柱短，節(jié)省溶劑 2 181。m 常應(yīng)用于超快速分離， high throughput, 分離度高 7 – 10 181。m 常用于半制備色譜柱 10 – 20 181。m 常用于制備色譜柱 126 HPLC 色譜柱結(jié)構(gòu) 類 型 內(nèi)徑 D (cm) 柱長 (cm) 粒徑 (181。m) 分析柱 – 3 25 3 10 微孔柱 , 15, 25 3 8 半制備柱 – 10 25 5 20 制備柱 – 10 25 5 20 127 鍵 合 相 ? 鍵合相 : – 反相 : 70%。 ? C18, 65%。 C8, 15%。 Cyano, 5%, 苯基柱 5%, – 正相 : 20%。 ? 硅膠、 NH CN – 其它 (手性柱 , 離子交換柱 ): 10% ? 反相色譜是目前應(yīng)用得最為廣泛的高效液相色譜方法。 ? C18 和 C8 在反相色譜終應(yīng)用得最為廣泛。 128 封 尾 ? 封尾是用如三甲基硅烷等小分子與鍵合了 C18以后的硅膠進行進一步的反應(yīng)。 ? 由于硅烷相對很大的體積，使得 C18 和其它鍵合相在發(fā)生鍵合反應(yīng)時只能覆蓋不到硅膠表面的 50% 。 ? 硅膠表面未被鍵合的酸性硅羥基將會與被分析物相互作用，特別是在中性條件下會對強堿性化合物產(chǎn)生嚴重的峰形拖尾。 ? 封尾工藝使得表面殘余的硅羥基被進一步的消除，為小分子所取代。 ? 封尾工藝能促使色譜柱對極性和堿性化合物的分離具有良好的峰形。 129 理論塔板數(shù) N 粒徑 (181。m) 柱長 (cm) 塔 板 數(shù) N 10 15 6,0007,000 10 25 8,00010,000 5 10 7,0009,000 5 15 10,00012,000 5 25 17,00020,000 3 5 6,0007,000 3 9,00011,000 3 10 12,00014,000 3 15 17,00020,000 色譜柱的柱效高意味著色譜柱裝填得好 130 評價色譜柱好壞的標準 1）理論塔板數(shù) N 2）拖尾因子 Tf 3）色譜柱背壓 4) 色譜柱批與批之間的重現(xiàn)性 5） pH值的適用范圍 6）使用壽命 131 拖尾因子 Tf As = 很 好 As = 一 般 As = 2 差 As = 4 很差 不對稱因子 和拖尾因子的關(guān)系 As (at 10%) Tf (at 5%) 不對稱因子 (As) = B A 拖尾因子 (Tf) = A + B 2A 10% 峰高 5% 峰高 132 色 譜 柱 背 壓 1. 粒徑均一會使色譜柱的背壓相對較低。 2. 色譜柱兩端的壓力降不應(yīng)超過公式計算所得的 30％。 3. 硅膠粒徑對色譜柱的壓力具有很大的影響；硅膠粒子越小，色譜柱的背壓越大。 4. 色譜柱的背壓還與流動相的粘度有關(guān)。 P = 3000Lη t0dp2 P 是色譜柱背壓 (psi)， L 是色譜柱的長度 (cm), η 流動相的粘度 (cP)， t0 是色譜柱死時間 , dp 是粒子的直徑 (181。m) 133 為什么色譜柱會失去作用 ? 1. 部分原因是色譜柱塞板或柱床被堵塞 —— 導(dǎo)致色譜柱背壓上升、峰形拖尾和柱效下降。 2. 吸附了樣品雜質(zhì) —— 導(dǎo)致柱效下降、選擇性和保留時間改變。 3. 色譜柱沒裝填好 —— 導(dǎo)致柱效下降和峰形拖尾。 4. 物理損傷或受熱引起的缺口 —— 導(dǎo)致柱效下降和峰形拖尾。 5. 對硅膠基質(zhì)或鍵合相的化學(xué)腐蝕 —— 導(dǎo)致選擇性變?nèi)?、峰形拖尾、保留能力下降（或?qū)A性化合物的保留能力增強）。 134 現(xiàn)代高效液相色譜柱的要求 1. 超純 B 型球形硅膠 —— 峰形好、柱效高。 2. 不能有使色譜性能降低的直徑小于 50 197。的微孔。 3. 粒徑尺寸從 3 181。m 到 10 181。m ——能滿足從分析到制備色譜規(guī)模的需求。 4. 色譜柱柱床裝填好 —— 使用壽命長、柱效高。 5. 封尾徹底 —— 峰形好、使用壽命長。 6. 批與批之間得重現(xiàn)性好。 7. 不同的相具有不同的選擇性 —— 能更好的實現(xiàn)分離。 8. 鍵合相化學(xué)穩(wěn)定好 —— 適用的 pH 范圍廣 , 使用壽命長。 135 為什么反相色譜應(yīng)用如此廣泛 ? ? 它能使中性化合物和極性化合物在一根色譜柱中得到分離。 ? 適用于多種基體中的多類不同性質(zhì)化合物的測定和分離。 ? 保留時間可以用分子的疏水性進行描述和解釋。 ? 所用高純度的水、甲醇和乙腈等溶劑價格便宜、實用。 ? 選擇性可通過用緩沖溶液進行調(diào)節(jié)（通過調(diào)節(jié) pH值來調(diào)節(jié)離子強度和膠團粒子大小等等），以實現(xiàn)最佳分離。 136 7. 檢測器的保養(yǎng) ? 在分析前、柱平衡得差不多時，打開檢測器；紫外檢測器的平衡時間大約需要 20分鐘，示差折光檢測器則更長。在分析完成后，馬上關(guān)閉檢測器。 ? 檢測池污染時，將柱拆下，用合適的溶劑沖洗污染物。