【正文】 DNA的去磷酸化，防止自我連接，以增加重組頻率 2) 核酸末端標(biāo)記 二 . 牛小腸堿性磷酸酶（ CIP） 與 BAP相同，只是 CIP對(duì)熱敏感 [γ32P]ATP ATP 5’ P OH 3’ 5’ 32P OH 3’ 3’HO P 5’ 3’ HO 32P 5’ I II 5’ P OH3’ 5’HO OH3’ 5’ P OH 3’ 3’HO P 5’ 3’HO OH5’ 3’HO P 5’ 磷酸酶 (I)與磷酸激酶 (II)活性 磷酸激酶的交換反應(yīng) 三 . T4 多聚核苷酸激酶 1. 催化反應(yīng)類型 1) 激酶活性（ 5’磷酸化酶）：可將 ATP中的 γ位的磷酸基轉(zhuǎn)移到 ssDNA， dsDNA和 RNA分子的 5’羥基端，在這反應(yīng)過程中可有兩種方式進(jìn)行（ ） ⅰ .轉(zhuǎn)移反應(yīng)； ⅱ .交換反應(yīng) 2) 3’磷酸酶活性（ pH 56） 2. 用途 1) 5’端末端標(biāo)記 2) 分子克隆過程中以獲得 5’磷酸基末端，便于連接酶反應(yīng) 四 . 末端轉(zhuǎn)移酶（ TdT） 1. 反應(yīng)特點(diǎn) 底物： dNTP及衍生物， 3個(gè)核苷酸，要求 3’OH端，需要 ssDNA作為引物，以 3’突起端的 dsDNA 為最高，亦可用于 dsDNA加尾 2. 核苷酸摻入速度 二甲基砷酸鹽緩沖液和 Mg2+可提高嘌呤核苷酸的摻入速度，而 Ca2+可提高嘧啶摻入速度 3. 用途 3’加尾，便于兩 DNA分子重組 。 3’末端標(biāo)記 五 . 多聚腺嘌呤聚合酶 該酶是在 RNA分子的 3’端（ OH）加上一個(gè)多聚 A的尾巴，其用途可標(biāo)記 RNA和 加尾的 RNA，可用于cDNA的合成 六 . 煙草酸性焦磷酸酶 可除去 mRNA帽子結(jié)構(gòu)中的焦磷酸 : m7GpppXpYpmRNA pXpYpmRNA 七 . 鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶 1. 催化類型 RNA三磷酸酶 : pppN(pN)n ppN(pN)n + Pi 鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶 : [α32P]GTP + ppN(pN)n G32pppN(pN)n + PPi RNA甲基轉(zhuǎn)移酶 : AdoMet + G(5’)pppN(pN)n m7G(5’)pppN(pN)n + AdoHCy 2. 用途：標(biāo)記 DNA 第八節(jié) 其 它 酶 類 1. 原生質(zhì)體的制備酶類 制備原生質(zhì)體目的：外源 DNA導(dǎo)入；核酸和蛋白質(zhì)的提取 溶菌酶， zymolyase， glusulase， NovoZyme，溶壁酶，纖維素酶 2. 蛋白質(zhì)降解酶類 蛋白酶 K 3. 檢測(cè)酶類 抗生蛋白鏈素 β 半乳糖苷酶 , 堿性磷酸酶 , 辣根過氧化物酶 練 習(xí) 題 1. 一種 DNA分子經(jīng)三種限制酶完全酶切后得如下結(jié)果： EcoRI 5kb EcoRI/HindIII 4kb HindIII 3kb 、 7kb EcoRI/PstI 5kb PstI 10kb HindIII/PstI 6kb 將各限制酶位點(diǎn)繪制在 DNA分子上。 2. 另一 DNA分子經(jīng)相同處理后得如下結(jié)果，將各限制酶位點(diǎn)標(biāo)在DNA分子上。 EcoRI 6kb EcoRI/HindIII 3kb HindIII 6kb EcoRI/PstI 5kb PstI 8kb HindIII/PstI 6kb DNA分子上有兩個(gè)限制酶 PstI和 EcoRI識(shí)別位點(diǎn)，兩位點(diǎn)相距 10bp，現(xiàn)有一研究生要分析 EcoRI右側(cè) 500bp區(qū)域內(nèi)的功能，他需要在這一區(qū)域內(nèi)獲得各種缺失突變體以確定某功能區(qū)，他應(yīng)如何設(shè)計(jì)此實(shí)驗(yàn)？假定 EcoRI— PstI間的 10bp除去后并不影響任何結(jié)果分析，但 PstI位點(diǎn)左側(cè)的 DNA不能除去 10bp 500bp PstI EcoRI 4. 假如 PstI位點(diǎn)為另一限制酶 HindIII，實(shí)驗(yàn)又該如何設(shè)計(jì)？ 5. 現(xiàn)有一研究者打算將一 EcoRI DNA片段克隆到另一個(gè) DNA分子的 BamHI位點(diǎn)以便 DNA擴(kuò)增，但擴(kuò)增后的 DNA分子又可用BamHI限制酶將插入的片段回收，如何設(shè)計(jì)此實(shí)驗(yàn)。 6. 一研究生要將一質(zhì)粒（ pI）上的 BamHIHindIII片段取代另一質(zhì)粒（ pII）上的 BamHIXbaI片段，所獲重組質(zhì)粒（ pIII）上的插入片段要求能用 BamHIHindIII進(jìn)行回收，問如何設(shè)計(jì)此實(shí)驗(yàn)？ 10bp 500bp HindIII EcoRI H Xb H 5kb pI 1kb 6kb pII .5kb 6kb pIII 1kb B B B 7. 現(xiàn)有一重組質(zhì)粒的限制酶譜和克隆到的基因轉(zhuǎn)錄方向入圖所示： 已知 HindIII克隆片段中的 BamHI（ 3kb）片段含有一完整的基因編碼區(qū)，現(xiàn)要將此 3kb的 BamHI片段克隆到另一表達(dá)載體 pB的BamHI位點(diǎn)，如何才能使插入片段與表達(dá)載體中的基因處于相同的閱讀框架？如何證明插入基因的轉(zhuǎn)錄方向是相同的？ HindIII PstI BamHI PstI BamHI BamHI HindIII pA 8kb pB 8. 為了檢測(cè)綠豆核酸酶對(duì) 5’端突起的單鏈 DNA切割是否準(zhǔn)確有效，即該酶只除去單鏈而不損傷雙鏈區(qū)。有一研究者設(shè)計(jì)了一套非常精巧的實(shí)驗(yàn)，其中一個(gè)實(shí)驗(yàn)是將一 XbaI片段插入 pBR322的Apr基因內(nèi)的 ScaI位點(diǎn)使該基因失活，然后再經(jīng)一系列實(shí)驗(yàn)證明綠豆核酸酶的作用確實(shí)與預(yù)期的結(jié)果一致，你能否設(shè)計(jì)出這一套實(shí)驗(yàn)？ (pBR322除含有 Apr基因外，還含有 Tcr基因 )。 9. 某研究者計(jì)劃將具有限制酶 BamHI粘性末端結(jié)構(gòu)的一段低聚核苷酸分子插入到一載體的克隆位點(diǎn)區(qū)。現(xiàn)假設(shè)他已獲得具有低聚核苷酸插入的重組質(zhì)粒，他應(yīng)做什么實(shí)驗(yàn)來檢查插入片段的方向 ScaI XbaI片段 Tcr（當(dāng)有外源 DNA插入， 該基因失活） pBR322 Apr Tcr 圖中字母代表的意義： NNotI； SpSpeI； SISacI； SfSflI； HHindIII； BBamHI； XbXbaI； SSalI； KKpnI； EEcoRI Apr H SI B Xb S K E N Sp SI Sf GATCC G G CCTAG pA 10. 一 DNA分子中有一個(gè) SmaI識(shí)別位點(diǎn) (CCCGGG), 現(xiàn)有一研究生想要將這識(shí)別位點(diǎn)順序完全除去 ,現(xiàn)已知該位點(diǎn)及兩側(cè)的序列為 ACCCGGGT,他應(yīng)該如何設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn) ? 11. 一研究者想在下列三種限制酶位點(diǎn)的 BamHI中插入另外一段低聚核苷酸 ,該段低聚核苷酸中的限制酶位點(diǎn)如下所示 , 要求獲得的重組 DNA分子的各種限制酶位點(diǎn)按一種方式排列 , 他應(yīng)如何設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分離到所需的 DNA分子 ? EcoRI BamHI HindIII BamHI SmaI SacI EcoRI PstI BamHI + E B P E SI Sm B H 12. 如何使下列的限制酶識(shí)別位點(diǎn)由一種序列變?yōu)榈诙N , 或由第一種變?yōu)榈谌N ? GATC GATATC GATCGATC； TCGA TCGCGA TCGCGCGCGA； Sau3AI EcoRV ClaI TaqI REII BssHI AAGCTT AAGCGCTT HindIII ThaI， HaeII BamHI位點(diǎn) , 一研究者想用體外缺失或插入的辦法使 BamHI位點(diǎn)消除 , 并獲得如圖所示的重組質(zhì)粒，他應(yīng)如何設(shè)計(jì)此實(shí)驗(yàn) ? 假定密碼子的增減對(duì)基因的抗性無任何影響。 HindIII EcoRI EcoRI EcoRI BamHI BamHI 位點(diǎn)消除 總長為 9kb Tcr