【正文】 DNA的去磷酸化，防止自我連接，以增加重組頻率 2) 核酸末端標記 二 . 牛小腸堿性磷酸酶（ CIP） 與 BAP相同，只是 CIP對熱敏感 [γ32P]ATP ATP 5’ P OH 3’ 5’ 32P OH 3’ 3’HO P 5’ 3’ HO 32P 5’ I II 5’ P OH3’ 5’HO OH3’ 5’ P OH 3’ 3’HO P 5’ 3’HO OH5’ 3’HO P 5’ 磷酸酶 (I)與磷酸激酶 (II)活性 磷酸激酶的交換反應 三 . T4 多聚核苷酸激酶 1. 催化反應類型 1) 激酶活性（ 5’磷酸化酶）：可將 ATP中的 γ位的磷酸基轉移到 ssDNA， dsDNA和 RNA分子的 5’羥基端，在這反應過程中可有兩種方式進行（ ） ⅰ .轉移反應； ⅱ .交換反應 2) 3’磷酸酶活性（ pH 56） 2. 用途 1) 5’端末端標記 2) 分子克隆過程中以獲得 5’磷酸基末端，便于連接酶反應 四 . 末端轉移酶（ TdT） 1. 反應特點 底物： dNTP及衍生物， 3個核苷酸，要求 3’OH端，需要 ssDNA作為引物，以 3’突起端的 dsDNA 為最高，亦可用于 dsDNA加尾 2. 核苷酸摻入速度 二甲基砷酸鹽緩沖液和 Mg2+可提高嘌呤核苷酸的摻入速度，而 Ca2+可提高嘧啶摻入速度 3. 用途 3’加尾，便于兩 DNA分子重組 。 3’末端標記 五 . 多聚腺嘌呤聚合酶 該酶是在 RNA分子的 3’端（ OH）加上一個多聚 A的尾巴，其用途可標記 RNA和 加尾的 RNA，可用于cDNA的合成 六 . 煙草酸性焦磷酸酶 可除去 mRNA帽子結構中的焦磷酸 : m7GpppXpYpmRNA pXpYpmRNA 七 . 鳥苷酸轉移酶 1. 催化類型 RNA三磷酸酶 : pppN(pN)n ppN(pN)n + Pi 鳥苷酸轉移酶 : [α32P]GTP + ppN(pN)n G32pppN(pN)n + PPi RNA甲基轉移酶 : AdoMet + G(5’)pppN(pN)n m7G(5’)pppN(pN)n + AdoHCy 2. 用途：標記 DNA 第八節(jié) 其 它 酶 類 1. 原生質體的制備酶類 制備原生質體目的：外源 DNA導入；核酸和蛋白質的提取 溶菌酶， zymolyase， glusulase， NovoZyme，溶壁酶，纖維素酶 2. 蛋白質降解酶類 蛋白酶 K 3. 檢測酶類 抗生蛋白鏈素 β 半乳糖苷酶 , 堿性磷酸酶 , 辣根過氧化物酶 練 習 題 1. 一種 DNA分子經三種限制酶完全酶切后得如下結果： EcoRI 5kb EcoRI/HindIII 4kb HindIII 3kb 、 7kb EcoRI/PstI 5kb PstI 10kb HindIII/PstI 6kb 將各限制酶位點繪制在 DNA分子上。 2. 另一 DNA分子經相同處理后得如下結果，將各限制酶位點標在DNA分子上。 EcoRI 6kb EcoRI/HindIII 3kb HindIII 6kb EcoRI/PstI 5kb PstI 8kb HindIII/PstI 6kb DNA分子上有兩個限制酶 PstI和 EcoRI識別位點，兩位點相距 10bp，現(xiàn)有一研究生要分析 EcoRI右側 500bp區(qū)域內的功能，他需要在這一區(qū)域內獲得各種缺失突變體以確定某功能區(qū)，他應如何設計此實驗？假定 EcoRI— PstI間的 10bp除去后并不影響任何結果分析，但 PstI位點左側的 DNA不能除去 10bp 500bp PstI EcoRI 4. 假如 PstI位點為另一限制酶 HindIII，實驗又該如何設計？ 5. 現(xiàn)有一研究者打算將一 EcoRI DNA片段克隆到另一個 DNA分子的 BamHI位點以便 DNA擴增，但擴增后的 DNA分子又可用BamHI限制酶將插入的片段回收，如何設計此實驗。 6. 一研究生要將一質粒（ pI）上的 BamHIHindIII片段取代另一質粒（ pII）上的 BamHIXbaI片段，所獲重組質粒（ pIII）上的插入片段要求能用 BamHIHindIII進行回收，問如何設計此實驗？ 10bp 500bp HindIII EcoRI H Xb H 5kb pI 1kb 6kb pII .5kb 6kb pIII 1kb B B B 7. 現(xiàn)有一重組質粒的限制酶譜和克隆到的基因轉錄方向入圖所示： 已知 HindIII克隆片段中的 BamHI（ 3kb）片段含有一完整的基因編碼區(qū)，現(xiàn)要將此 3kb的 BamHI片段克隆到另一表達載體 pB的BamHI位點，如何才能使插入片段與表達載體中的基因處于相同的閱讀框架？如何證明插入基因的轉錄方向是相同的？ HindIII PstI BamHI PstI BamHI BamHI HindIII pA 8kb pB 8. 為了檢測綠豆核酸酶對 5’端突起的單鏈 DNA切割是否準確有效，即該酶只除去單鏈而不損傷雙鏈區(qū)。有一研究者設計了一套非常精巧的實驗，其中一個實驗是將一 XbaI片段插入 pBR322的Apr基因內的 ScaI位點使該基因失活，然后再經一系列實驗證明綠豆核酸酶的作用確實與預期的結果一致，你能否設計出這一套實驗？ (pBR322除含有 Apr基因外，還含有 Tcr基因 )。 9. 某研究者計劃將具有限制酶 BamHI粘性末端結構的一段低聚核苷酸分子插入到一載體的克隆位點區(qū)?，F(xiàn)假設他已獲得具有低聚核苷酸插入的重組質粒，他應做什么實驗來檢查插入片段的方向 ScaI XbaI片段 Tcr（當有外源 DNA插入， 該基因失活） pBR322 Apr Tcr 圖中字母代表的意義： NNotI； SpSpeI； SISacI； SfSflI； HHindIII； BBamHI； XbXbaI； SSalI； KKpnI； EEcoRI Apr H SI B Xb S K E N Sp SI Sf GATCC G G CCTAG pA 10. 一 DNA分子中有一個 SmaI識別位點 (CCCGGG), 現(xiàn)有一研究生想要將這識別位點順序完全除去 ,現(xiàn)已知該位點及兩側的序列為 ACCCGGGT,他應該如何設計實驗 ? 11. 一研究者想在下列三種限制酶位點的 BamHI中插入另外一段低聚核苷酸 ,該段低聚核苷酸中的限制酶位點如下所示 , 要求獲得的重組 DNA分子的各種限制酶位點按一種方式排列 , 他應如何設計實驗分離到所需的 DNA分子 ? EcoRI BamHI HindIII BamHI SmaI SacI EcoRI PstI BamHI + E B P E SI Sm B H 12. 如何使下列的限制酶識別位點由一種序列變?yōu)榈诙N , 或由第一種變?yōu)榈谌N ? GATC GATATC GATCGATC； TCGA TCGCGA TCGCGCGCGA； Sau3AI EcoRV ClaI TaqI REII BssHI AAGCTT AAGCGCTT HindIII ThaI， HaeII BamHI位點 , 一研究者想用體外缺失或插入的辦法使 BamHI位點消除 , 并獲得如圖所示的重組質粒，他應如何設計此實驗 ? 假定密碼子的增減對基因的抗性無任何影響。 HindIII EcoRI EcoRI EcoRI BamHI BamHI 位點消除 總長為 9kb Tcr