【正文】 β內(nèi)酰胺酶 總活力 /底物專一性 DNA改組枯草桿菌蛋白酶 BPN′ 穩(wěn)定性 盒式誘變對硝基苯酯酶 底物專一性 /有機相活性 易錯 PCR/DNA改組 胸腺嘧啶核苷激酶 底物專一性 盒式誘變β半乳糖苷酶 底物專一性 DNA改組綠色熒光蛋白 熒光 DNA改組核酶 底物專一性 易錯 PCR/DNA改組天冬氨酸酶 活性與穩(wěn)定性 隨機 /定位誘變藥物和疫苗 活性 /專一性 /最佳表達 DNA改組酶的體外定向進化應用實例酶的體外定向進化應用實例回本章目錄定向進化與自然進化的異同點216。 定向進化的實質(zhì)是達爾文進化論在分子水平上的延伸和應用。216。 定向進化是在體外模擬突變、重組和選擇的自然進化，使進化朝著人們需要的方向發(fā)展。216。 兩者的不同：?進化動力不同： 保守突變 非保守取代；?進化方向不同： 適應突變的積累； ?進化速度不同： 非常漫長 只需幾年、甚至幾天； ? 進化目標不同： 適應環(huán)境 超越生物學意義的要 求，探索所希望的蛋白質(zhì)在順序空間的可及性。 定向進化技術Fig. 1. Publication rate of the ‘directed evolution’ articles in biomedical literature between 1995 and 2022. The analysis was achieved using the National Institutes of Health MEDLINE bibliographic database. The figure shows the total number of articles published each year, which contain the key words ‘directed evolution’ in their titles.展望 總之，具有新功能和特性的酶可以通過從大量未知的自然種系中尋找以及對現(xiàn)有的天然酶進行改造，對現(xiàn)有的天然酶進行改造可能更加合適。 我們相信，隨著 基因工程技術 、 蛋白質(zhì)工程技術 以及 高通量篩選技術 的迅速發(fā)展，定向進化技術將成為獲得新酶的一個有效快捷的手段，這將為工業(yè)生產(chǎn)提供更多性能優(yōu)良的酶制劑。附 1 酶的穩(wěn)定性 1）共價鍵 ： 肽鍵 （ peptide bond） —— 穩(wěn)定蛋白質(zhì)和酶主鏈的核心力量。 二硫鍵 （ disulfide bond） —— 由兩個 Cys的側(cè)鏈 SH氧化而成，是某些蛋白質(zhì)維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的主要因素。2）非共價鍵：疏水相互作用 （ hydrophobic interaction） : 是維持蛋白質(zhì)分子穩(wěn)定的主要的作用力。氫鍵 （ hydrogen bond）： 是穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)，特別是二級結(jié)構(gòu)的重要力量。靜電相互作用 （ electrostatic interaction）： 又稱離子鍵、鹽鍵、鹽橋，是正負電荷間的作用力。對酶分子穩(wěn)定性有關的鹽鍵大部分形成于分子表面上。范德華力 ： 在電中性分子之間的非共價結(jié)合。分子間形成的范德華力越大越穩(wěn)定。金屬離子 ： Ca2+、 Mg2+和 Zn2+等高價陽離子與多肽鏈不穩(wěn)定的彎曲部分結(jié)合，可顯著增加酶分子的穩(wěn)定性。途徑 方法 優(yōu)點 不足酶分子改造核酸水平 蛋白質(zhì)工程 從根本上提高酶分子穩(wěn)定性操作復雜，周期長蛋白質(zhì)水平 化學修飾 適應所有酶，操作簡單經(jīng)濟修飾過程破壞酶分子劑型 固定化 適應所有酶，穩(wěn)定性高，可重復利用和連續(xù)生產(chǎn)載量較低，易失活交聯(lián)酶晶體 穩(wěn)定性好，載量高，催化效率高成本高微環(huán)境改良 穩(wěn)定劑 簡單、經(jīng)濟 工作量大反應介質(zhì) 適用于特殊反應體系和酶類適合的酶類還不普遍2. 穩(wěn)定酶的方法附 2：酶的活性中心（ active site） 一、活性中心的概念v酶的必需基團酶的必需基團 (essential group): 與酶活性有關的基團與酶活性有關的基團v酶的活性中心酶的活性中心 (active center): 由必需基團構(gòu)成的與酶催化活性有關的特定區(qū)域由必需基團構(gòu)成的與酶催化活性有關的特定區(qū)域 . 酶分子非必需基團必需基團活性中心必需基團活性中心外必需基團結(jié)合基團催化基團非活性中心活性中心活性中心的重要化學基團 7種氨基酸出現(xiàn)的頻率最高 Lys Asp Glu Cys His Tyr Ser （蘭天果拌豬肉絲） 某些功能基團 ,如（氨基、羧基、巰基、羥基 和咪唑基）是酶的必需基團。 賴氨酸的氨基 天冬氨酸和谷氨酸的羧基 半胱氨酸的巰基 組氨酸的咪唑基 酪氨酸和絲氨酸的羥基 與底物相結(jié)合，使底物與酶的一定構(gòu)象形成復合物 影響底物中某些化學鍵的穩(wěn)定，催化底物發(fā)生化學反應并將其轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物 維持酶活性中心應有空間構(gòu)象所必需的基團 二、活性中心的共性(1)活性部位只占酶分子很小的一部分（ 12%）。(2)活性部位是一個三維實體。(3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂縫中。 (4)活性中心構(gòu)象不是固定不變的（誘導契合）。(5)酶與底物通過鹽鍵、氫鍵、范德華力和疏水作用等次級鍵結(jié)合。Active siteThe active site is the region of the enzyme that binds the substrate, to form an enzymesubstrate plex, and transforms it into product. The active site is a threedimensional entity, often a cleft or crevice on the surface of the protein, in which the substrate is bound by multiple weak interactions.三、研究酶活性中心的方法 ： 用 X射線衍射法直接檢測底物或其類似物與酶形成的中間復合物（包括酶和底物）的相對位置。 ： 根據(jù)所用修飾試劑不同，分為 1)非專一性化學修飾 用非專一性的修飾試劑與氨基酸側(cè)鏈基團作用 。若某基團被修飾后： 酶活性不變 —— 該基團可能不是酶的必需基團酶活性降低或喪失 —— 該基團可能是酶的必需基團但不能確定化學試劑是同活性中心內(nèi)的必需基團結(jié)合 ?；钚灾行幕鶊F的鑒定標準① 失活程度與修飾劑濃度成一定比例關系。② S或可逆抑制劑有保護作用（活性中心）。先加 S或競 Ⅰ 加共價修飾劑 透析除去 S或競 Ⅰ 活性不喪失 差別標記：底物或抑制劑存在 活性基團不與修飾劑作用去除底物或抑制劑 原來被保護的基團帶同位素標記 可直接得到蛋白質(zhì)發(fā)揮功能作用的必需基團?；瘜W修飾含同位素標記 的同樣試劑2)專一性化學修飾（基團專一性修飾） 用專一性化學修飾劑修飾酶活性中心的某一氨基酸殘基的側(cè)鏈基團。3)親和標記（位點專一性修飾） 采用的修飾試劑是根據(jù)底物的化學結(jié)構(gòu)設計合成的含有活潑反應基團的底物類似物。作用機制： 利用酶對底物的特殊親和力將酶加以修飾標記?；瘜W修飾的專一性YYYXYYYX親和修飾劑： ① 與 S結(jié)構(gòu)相似 ，與活性中心的氨基酸殘基 親和力大，而與活性中心以外的氨基酸 殘基親和力小。② 具有活潑的化學基團 （如鹵素）可與活性 中心的基團形成穩(wěn)定的共價鍵