【正文】 起 ２）富含ＧＣ ３）對稱性 — 雙 對稱 EcoRI 5’G A A T T C3’ 3’C T T A A G5’ ４）切點大多數(shù)在識別順序之內(nèi)，也有例外 ５）限制酶切后產(chǎn)生兩個末端，末端結(jié)構(gòu)是５’ Ｐ和３’ ＯＨ 2. 末端種類 １） ３’ 端突起 ，個數(shù)為２或４個核苷酸 Pst I 5’CTGCAG3’ 5’CTGCA G3’ 3’GACGTC5’ 3’G ACGTC5’ ２） ５’ 端突起 ，個數(shù)為２或４個核苷酸 EcoRI 5’GAATTC3’ 5’GOH PAATTC3’ 3’CTTAAG5’ 3’CTTAAP HOG5’ ３） 平齊末端 SmaI 5’CCCGGG3’ 5’CCC GGG3’ 3’GGGCCC5’ 3’GGG CCC5’ ４）非互補的粘性末端 ａ）切點在識別順序之外的，如： FokI Fok I 5’GGATG(Ｎ )93’ 5’GGATG(N)9 3’CCTAC(Ｎ )135’ 3’CCTAC(N)13 ｂ）能識別簡并順序的，如： AvaI AvaI 5’CPyCGPuG3’ CCCGGG。 3. SV40 限制圖譜和轉(zhuǎn)錄圖譜的繪制 D. Nathans（ 1971年）用 HindII繪制 SV40的限制酶譜。 二 . 限制修飾系統(tǒng)的種類 1. I型 ： 由三個基因構(gòu)成， hsdR； hsdM； hsdS（ host specificity for DNA restriction modification and specificity）位于染色體上，三個基因構(gòu)成一個復合體，限制酶需要 ATP、 Mg2+、SAM（５ — 腺苷甲硫氨酸）。 C TCGGG。 七 . 其它特異性的內(nèi)切酶及其用途 1. λ末端酶（ λ terminase）： 5’GGGCGGCGACCTN3’ N5’，出現(xiàn)的頻率約 412 分子量為 117,000 = 1 A（ 74,000） + 2 Nul（ 21,000） 2. Omega核酸酶（ ISceI）： 由內(nèi)含子編碼，用于 rRNA的剪切，出現(xiàn)的頻率約 418 = X 1010 bp， 其識別順序為 5’TAGGGATAACAGGGTAAT3’ TATT 3. IPpoI： 來自于 Physarum polycephalum 識別序列： CTCTCTTAA GGTAGC AATT 4. 用途 遺傳標記， 構(gòu)建載體 八 . 限制酶的用途 1. DNA重組 2. 限制酶（物理）圖譜繪制 3. 突變分析（ RFLP分析） 4. 限制酶的部分酶切與完全酶切 附： IIS型限制酶的特點 1. 具有特異型核苷酸順序識別能力，但該順序不具有對稱結(jié)構(gòu)。 4. E． coli中依賴于甲基化的限制修飾系統(tǒng)mrr（ mA/A）、 mcr(Am5CG)、 merB（ Pum5C） 二 . 甲基化酶活性對限制酶活性的影響 1. dcm 和 dam甲基化酶對限制酶的影響 1）抑制某些限制酶的活性，不管兩種限制酶的識別順序是完全重疊還是邊界重疊 如：完全重疊 BclI— dam(GATC)； ScrFI— dcm(CCA/TGG) 邊界重疊 ClaIdam； Sau96Idcm 2）不能抑制某些限制酶活性，不管兩者的識別順序為何種重疊 如： damBamHI， Sau3AI， BglII， PvuI； dcmBstNI 表 2 對甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶 限制酶 識別序列 * 甲基化酶 AvaⅡ GG(A/T)CC(A/T)GG dcm BclⅠ TGATCA dam ClaⅠ GATCGAT dam EcoRⅡ CC(A/T)GG dcm HphⅠ GGTGATC dam MboⅠ GATC dam NruⅠ GATCGCGA dam Sau96Ⅰ GGNCC(A/T)GG dcm SauFⅠ CC(A/T)GG dcm StuⅠ AGGCCTGG dcm TagⅠ GATCGA dam XbaⅠ TCTAGATC dam *下橫線字母表示限制酶識別序列 , 綠色字母表示 dam甲基化酶識別序列 ,紅色字母表示 dcm甲基化酶識別序列 2. II型甲基化酶對限制酶活性的影響 １） 抑制同種限制酶的活性 GGATmCC— BamHI(G?GATCC) GAmATTC— EcoRI(G?AATTC) ２） 抑制不同種限制酶的活性 a. 順序完全重疊 如： M. ClaI（ ATCGmAT） TaqI（ TCGmA） b. 順序邊界重疊 如： M. BamHI（ GGATmCC） MepI（ mCCGG） ３） 抑制不同種限制酶的部分活性 M． TaqI（ TCGmA） HindII（ GTPyPuAC）： GTCAAC，GTTAAC， GTCGmAC， GTTGAC 3. 甲基化酶的用途 １） 改變某些限制酶識別順序的特異性，以便重組體的形成 ２） 在建立基因文庫時，可先使 DNA分子部分甲基化，然后再用限制酶切 表 3 甲基化酶與識別序列 甲基化酶 識別序列 a 受甲基化影響的限制酶 b Ⅰ AG mCT AluⅠ, BamHⅡ, Bsp1286 DdeⅠ, HgiAⅠ, NheⅠ, PstⅠ Ⅰ GGAT mCC BamHⅠ, MspⅠ Ⅰ ATCG mAT ClaⅠ, MboⅠ, TaqⅠ dam GmATC c dcm CCA/TGG c Ⅰ GA mATTC EcoRⅠ GCNGC GGmCC MstⅠ, PstⅠ, PvuⅡ Ⅲ GG mCC BanⅡ, BglⅠ, Bsp1286,BstXⅠ, HaeⅢ, MspⅠ, NaeⅠ, NcoⅠ, SacⅡ, Sau96Ⅰ Ⅰ G mCGC AhaⅡ, FnuDⅡ, HhaⅠ Ⅱ C mCGG AhaⅡ, AvaⅠ, AvaⅡ, HpaⅡ, ScrFⅠ Ⅰ T mCACC HinfⅠ, HphⅠ, Sau3AⅠ Ⅰ mCCGG BamHⅠ, MspⅠ Ⅰ CTGC mAG AluⅠ, PstⅠ Ⅰ TCG mA AluI, AvaⅠ, EcoRV, HinCⅡ, HinfⅠ, MboⅠ, TaqⅠ, XmnⅠ m表示該堿基被甲基化 。 一 . 外切酶 III（ ExoIII） 1. 一般特點： 來自于 ，分子量 28,000 kD 2. 催化反應類型 1) 外切酶活性： 3’ 5’，產(chǎn)生 5’單磷酸核苷酸和具各種結(jié)構(gòu)的 dsDNA， pH 2) 核酸酶 H活性：除去 DNARNA雜交分子中的RNA分子， pH 3) 3’磷酸酶活性：除去 3’磷酸基后形成 3’OH端，有利于 DNA聚合酶反應， pH 4) 內(nèi)切酶活性：在無嘌呤或無嘧啶處將 DNA鍵切開， pH 3. 外切酶活性特點 1) 反應底物：互補 dsDNA 2) 堿基釋放速度： CATG 3) 反應產(chǎn)物： 5’單磷酸核苷和具缺口或 5’端突起的 dsDNA，過度反應將導致 DNA降解 4. 用途 1) 核酸（ DNA）標記 2) 基因突變 缺失 3) DNA序列測定時作順序缺失 5. 使用注意事項 1) 正式使用前，測定在一定條件下酶的反應速度 2) 在一定條件下， ExoIII不能作用 GC富集區(qū) (來自于 cDNA加尾 ) 539。HO 339。 OH339。 339。 339。 繪制限制酶譜 。 539。 1. RNase A分離自牛胰臟，對熱穩(wěn)定，抗去污劑（ 100℃ 加熱 15min仍具活性） , 用于除去 DNA樣品中的 RNA分子 2. 核酸酶 S7， 亦稱微球菌核酸酶，對 RNA敏感，用于除去蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)中的內(nèi)源