【正文】 5min；(3) 加入LB培養(yǎng)基400 181。L，37℃下600rpm培養(yǎng)1h，使細胞復蘇；(4) 取100181。L轉化的細菌液均勻涂于含有100 181。g/mL Amp的LB平板上(含有100 181。L XGal 和20 181。L IPTG) ，在室溫下放置2030 min，待溶液被充分吸收后，倒置于37℃培養(yǎng)1216 h，通過觀察平板上的細菌菌落可以初步確定含有重組質粒的菌落，還需通過質粒單雙酶切和基因測序來進一步鑒定。(1) 從LB平板上挑選白色單菌落，轉接到含Amp（終濃度為75181。g/mL）的LB液體培養(yǎng)基中擴增，于37℃，250rpm搖床中培養(yǎng)。(2) 轉接四個小時后，取出1ml 菌液并加入150 181。L甘油對菌種進行保存，置于－70℃冰箱中。(3) 擴增12~16 h后，使用質粒提取試劑盒Plasmid Miniprep Kit從宿主菌中提取質粒，具體步驟按照試劑盒的使用說明書。(4) 分別用限制性酶NdeI與EcoRI雙酶切檢測抽提出來的質粒是否為連接了目的基因的質粒，： 連接后的單、雙酶切Table Single and double digestion after expression vectorComponents雙酶切用量(μL)ddH2O4pET22bELPs[KV8F20]310K buffer110M buffer－%BSA1NdeIEcoRI混勻，于37℃反應8 h，酶切產(chǎn)物經(jīng)DNA電泳分離，然后通過凝膠成像系統(tǒng)觀察酶切片段是否為預期大小。 ELPs[KV8F20]的表達與純化 [KV8F20]的誘導表達將含有重組質粒的大腸桿菌轉接到含Amp（終濃度為100 μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，在250 rpm轉速和37℃溫度下過夜培養(yǎng)（約需1012 h）。取50μL菌液轉接到含Amp（終濃度為100 μg/ mL）的新鮮TB培養(yǎng)基中，37℃下250 ，加入IPTG誘導（終濃度為1 mM），誘導4小時，4 ℃，4000 rpm離心15 min，收獲菌體，用預冷的PBS緩沖液重懸菌體，然后置冰浴中超聲破菌(超聲2 s，間隔2 s，共4 min)。 ELPs 的純化ELPs純化采用ITC（inverse transition cycling），即在大腸桿菌破碎液，向其加入聚乙烯亞胺（%）以去除核酸；4℃，13000 rpm離心15 min，取上清，向上清液中添加 NaCl 至終濃度為 2 mol/L，37℃水浴 15 min 后，13 000 rpm，離心 15 min 去上清；向沉淀中加入預冷的PBS 溶解沉淀，冰浴15 min 后，4℃，13 000 rpm，離心 15 min；向上清液中再添加NaCl 至終濃度為 2 mol/L，37℃水浴15 min 后，13 000 rpm，離心 15 min 去上清；向沉淀中加入預冷的 PBS 溶解沉淀，冰浴 15 min，4℃ 13 000 rpm，離心 15 min，收集上清液。ELPs的純度與分子量通過SDSPAGE驗證。 色氨酸標準曲線制作及ELP[KV8F20]的定量：（1）配1000 ml的10 mmol/L的色氨酸溶液， g色氨酸，用去離子水溶解，定容于1000 ml容量瓶。（2）稀釋，用移液槍取10 ml的10 mmol/L色氨酸溶液，用去離子水定容于100 ml容量瓶，制成1mmol/L色氨酸溶液。用移液槍取10 ml的1mmol/L色氨酸溶液，用去離子水定容于100 ml容量瓶，制成100μmol/L色氨酸溶液。（3）按表41，用移液槍將100 μmol/L的色氨酸溶液加到10 ml容量瓶中，然后加去離子水定容，配成不同濃度的色氨酸溶液。（4）用去離子水做空白對照，進行校正，然后測定不同濃度色氨酸溶液在紫外光280 nm波長的光吸收值，并記錄數(shù)據(jù)。（5）根據(jù)所得數(shù)據(jù)制作L色氨酸的OD280標準曲線采用紫外分光光計測定Trp 的在280 nm 處的消光系數(shù)，建立標準曲線。測定ELP[KV8F20]的在280 nm 的消光系數(shù)，并與標準曲線進行比對，從而可以對 ELPs濃度進行定量[58]。 ELP[KV8F20]蛋白的透析(1)將透析管剪成適當長度(10～20cm)的小段，即形成透析袋。 (2)在大體積的2%(m/v)碳酸氫鈉和10 mmol/L EDTA(pH )中將透析袋煮沸10 min。(3)將透析袋用蒸餾水徹底漂洗。 (4)將透析袋置1mmol/L EDTA(pH )中煮沸10min。 (5)待透析袋冷卻，存放于4℃去離子水，應確保透析袋始終浸沒在液體中。注意：從此步起用透析袋時一定要戴手套操作。 (6)在使用之前要用蒸餾水將透析袋里外加以清洗。（1）用透析袋夾夾緊透析袋底部，確保液體不會滲漏出。（2）用移液槍取純化后的蛋白質溶液，每個透析袋分裝15 ml蛋白質溶液。（3）用手趕走透析袋內(nèi)部的空氣，并用棉繩扎緊透析袋上端，防止漏液。（4）用容器盛大量的超純水，將透析袋完全浸泡在超純水中進行透析，每隔3 h換一次超純水。（5）約透析2天后，測定透析袋外超純水的電導率，將電導率換算成電阻率，當R=18時，停止透析，收集透析袋內(nèi)的蛋白質溶液，并存于0℃冰箱。將透析后所收集的ELPs蛋白質溶液進行冷凍干燥制成蛋白質粉末，并收集保存。 ELP[KV8F20]相變溫度測定及鹽對其相變溫度影響的測定測定ELP[KV8F20]相變溫度參考文獻[57]根據(jù)參考文獻，得到測定ELP[KV8F20]相變溫度的方法。，即：測定 10176。C 至 95176。C ELPs的 PBS溶液（ELPs終濃度為25μM）在 A350處的濁度，升溫的速率為 1℃/min。鹽對ELP[KV8F20]相變溫度影響的測定參考文獻刪掉[59]，即將鹽溶解在10 mM 的磷酸鹽緩沖溶液(pH =)，配制各種鹽的濃度梯度。將冷凍干燥后的 ELPs溶解于鹽濃度中，ELPs的終濃度為25 μM，并測定其在 A350處不同溫度下的濁度。即將冷凍干燥后的 ELPs溶解于磷酸鹽緩沖液配制的不同梯度的鹽溶液中，ELPs的終濃度為25 μM，并測定其在 A350處不同溫度下的濁度。相變溫度為OD350最大值的一半所對應的溫度[57]。SDSPAGE 鑒定(1) 制膠：配制15%分離膠和5%濃縮膠，在閉光條件下制膠；(2) 樣品制備：將過夜活化后的甘油菌轉接到含Amp的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)生長期（約4~5 h），向其中加入終濃度為1mM的IPTG誘導不同時間，以未經(jīng)誘導的重組菌為對照。于4000 r/min，離心10 min收集菌體，分別收集胞外、胞內(nèi)粗酶液。向其中加入5 μL 5上樣緩沖液，沸騰5 min，上樣；(3) 上樣：樣品各取20 L，蛋白質Marker取2 μL；(4) 電泳：用1電泳緩沖液，濃縮膠采取100 V低壓，分離膠采取120 V高壓電泳，；(5) 脫色和染色：考馬斯亮蘭染色液染色1h左右，再脫色液脫色過夜，直至可看到清晰條帶為止；(6) 凝膠成像：將凝膠置于成像系統(tǒng)中，于白色燈光下觀察并拍照。 pUC19ELPs的酶切及ELPs基因片段回收依據(jù)ELP[KV8F20]的氨基酸序列（100個氨基酸），考慮大腸桿菌的密碼子使用情況，從頭設計其基因序列（300bp），將其連入克隆載體pUC19，經(jīng)測序列，pUC19ELPs質粒構建正確。利用pflMⅠ與BglⅠ對ELP[KV8F 20]基因片段回收，可見線性克隆載體片段與大小為300 bp 的基因片段，符合預期大??；再將此基因導入到用SfiⅠ酶切 修飾后的pET22 b表達載體中[57]，構建pET22 bELPs表達載體，使用NdeI與EcoRI對該表達載體進行雙酶切鑒定，可見線性表達載體片段和大小為332 bp 的基因片段，與預期結果一致；結合測序結果，表明表達載體構建正確。之后，將該pET22 bELPs導入到E. coli BL21 (DE3)宿主菌中，構建工程菌。：pUC19ELP質粒圖譜 重組pET22(b)ELPs 的酶切鑒定Fig. Identification of constructs with digestion by Nde Ι and EcoR Ι endonuclease. 1: digested pET22(b)ELP by Nde Ι and EcoR Ι endonuclease。 2: DNA marker.—5000—3000—2000—1500—1000—750—500—250—1001 2 圖 使用pflM Ι與BglΙ酶切回收ELPs基因Fig. Recovery ELP gene with digestion by pflMΙ and BglΙ endonuclease. 1: digested pET22(b)ELP by pflM Ι and BglΙ endonuclease。 2: DNA marker.1 2—5000—3000—2000—1500—1000—750—500—250—100Fig ：The vector map for pUC19ELP ELP[KV8F20]的誘導表達與純化含有pET22bELP[KV8F20]重組質粒的BL21工程菌，經(jīng) IPTG誘導后，收集菌體，并細胞破碎后，采用ITC純化，表明在 11kDa處有一條帶，這與 ELP[KV8F20]]理論分子量大理論分子量9kd相比大20％，與相關的ELP[KV8F20]報道吻合[5860]。，兩輪ITC之后，與細胞破碎液相比，目的蛋白質在純化的過程中并沒有太大損失，因而可認為ITC可以保證目的蛋白較高的回收率。，經(jīng)兩輪ITC之后，在11 kDa處有單一條帶，已達表明，不僅可以達到較高的純化目的到純化目的，此外同時，ITC過程也是一個蛋白濃縮的過程。: 表達純化的ELPs（SDSPAGE） Expression and purification of the ELPs. The ELPs was expressed in E. coli,purified by ITC and analyzed by SDSPAGE1 the purified ELPs after two rounds ITC was dissolve in PBS ,whose volume was equal with cell lysates,2 the purified ELPs after one rounds ITC was dissolve in PBS ,whose volume was equal with cell lysates,3:total proteins after induction,4:Maker表達純化的ELPsFig. 3 Expression and purification of the ELPs. 1: the purified ELPs after two rounds ITC。 2: the purified ELPs after one rounds ITC。 3: total proteins after induction。 4: Maker.1 2 3 4—40 kDa—25 kDa—15 kDa—10 kDa:使用足量與少量PBS溶解純化后ELP沉淀（SDSPAGE）Fig. ELPs was dissolve in adequate and small amount of Maker,2 purified ELPs after two rounds ITC ELPs was dissolve in adequate amount of PBS,3 purified ELPs after two rounds ITC ELPs was dissolve in small amount of PBS1 2 340kDa —25kDa —15kDa —10kDa — ELP[KV8F20]相變溫度的影響因素考察:ELP[KV8F20]的濃度對相變溫度的影響根據(jù)不同濃度ELP[KV8F20]的溫度與濁度關系得到圖實驗測得溫度與濁度關系，：Fig The curve of different concentrations for ELPsat OD350 Obtained transition temperature throught curve of OD350在ELP[KV8F20]的相變發(fā)生階段，溫度上升12℃時，導致 ELP[KV8F20]混濁度急劇的增加，相變溫度()的定義為OD350最大值的一半所對應的溫度。，當OD350=1/2O OD350 max，此時的溫度（T）為ELP[KV8F20]的相變溫度（）。 不同濃度下ELP[KV8F20]相變溫度Fig Different concentrations ELP[KV8F20] corresponding to different transition temperature根據(jù)的求法，[KV8F20]的相變溫度,。[KV8F20]的相變溫度與ELP[KV8F2