【正文】 懸空滴加50～200 μL經(jīng)65℃水浴預(yù)熱的洗脫液，于室溫下放置5 min，然后12000 rpm離心1 min。10）為了增加質(zhì)粒的回收率，可以將上步離心得到的洗脫液重新滴加到吸附柱中，并在室溫下放置5 min，12000 rpm離心1 min。11）離心管中的液體即為提取的質(zhì)粒，20℃保存?zhèn)溆谩?質(zhì)粒載體和目的片段的酶切質(zhì)粒和目的片段的酶切體系如表27：表27 酶切體系Table 27 Components of enzyme digestion system組分加樣量10Buffer 10 μL質(zhì)?！?2 μg酶2 μLddH2OAdd to 40 μL反應(yīng)條件為37℃（或30℃）水浴3~4 h，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。 酶切載體的去磷酸化選用牛小腸堿性磷酸酶（Calf Intestine Alkaline Phosphatase，CIAP）對酶切回收后的載體進(jìn)行去磷酸化處理，如表28，去磷酸化體系按照60 μl標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系進(jìn)行。表28 去磷酸化體系Table 28 Components of dephosphorylation system組分加樣量10Alkaline Phosphatase Buffer 6 μL質(zhì)粒 ≤1 μgCIAP（1 U/μL） 2 μLddH2O Add to 60 μL反應(yīng)條件：先37℃水浴30 min，然后再50℃水浴30 min。將去磷酸化后的產(chǎn)物按照PCR產(chǎn)物純化回收的步驟進(jìn)行回收，然后置于20℃保存。 質(zhì)粒載體與目的片段的連接 質(zhì)粒載體與目的片段進(jìn)行連接的體系見表29：表29 連接體系Table 29 Components of ligation system組分加樣量載體DNAx μL目的片段y μLSolution I5 μL反應(yīng)條件：載體與目的片段的摩爾比為1:31:10，16℃恒溫條件下連接過夜。 酵母轉(zhuǎn)化酵母醋酸鋰轉(zhuǎn)化法[7879]的主要操作步驟如下：（1）酵母感受態(tài)的制備1）取斜面酵母菌種一環(huán)于5 mL YEPD液體培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)過夜。2）將上述過夜培養(yǎng)的菌液接種至裝有50 mL YEPD液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)至細(xì)胞濃度為2107個(gè)/mL（3～5 h），此時(shí)菌體處于對數(shù)期。3）將菌液轉(zhuǎn)至50 mL無菌離心管中，5000 rpm離心5 min，棄除上清液，再用25 mL無菌水洗滌兩次，并棄去上清；4）用1 mL mol/L的LiAc緩沖液重新懸浮酵母菌體， mL的EP管中。5）離心，棄除上清， mL的LiAc/TE緩沖液重新懸浮，每管50 μL進(jìn)行分裝，離心后，用移液槍小心吸除上清，并立即進(jìn)行轉(zhuǎn)化。（2）轉(zhuǎn)化1）將1 mL鮭魚精DNA煮沸5 min，并快速在冰上冷卻。2）對于每一個(gè)轉(zhuǎn)化，都要小心按下列順序加入“轉(zhuǎn)化混合液”：PEG3350（50% m/v） 240 μL mol/L乙酸鋰 36 μLssDNA（ mg/mL） 50 μL轉(zhuǎn)化片段（～10 μg） 34 μL3）劇烈振蕩直到完全混勻。4）30℃恒溫箱中保溫30 min。5）42℃水浴中熱激40 min。6）13000 rpm離心30 s，去除上層轉(zhuǎn)化液，然后加入1 ml YEPD重新懸浮菌體，30℃100 rpm振蕩培養(yǎng)4 h。7）離心去除上清液，用200～500 μL無菌水重新懸浮菌體，然后取適量菌液涂布G418抗性YEPD平板，培養(yǎng)2~3 d后挑取能夠正常生長的轉(zhuǎn)化子。 G418抗性基因的去除本研究擬采用CreLoxP報(bào)告基因挽救系統(tǒng)[8081]，來剔除報(bào)告基因KanMX。首先利用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒pGAPza轉(zhuǎn)入酵母中，然后通過半乳糖誘導(dǎo)后，稀釋涂布于無抗性的YEPD平板。待培養(yǎng)出單菌落之后，將單菌落對應(yīng)點(diǎn)接到無抗性的YEPD平板和含有G418抗性的YEPD平板上，置于30℃恒溫條件下培養(yǎng)2~4 d，挑取在無抗性YEPD平板上生長而在含G418抗性平板上不生長的菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子的KanMX基因是否去除。 黃酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 種子培養(yǎng)（1）菌種活化：取保存于甘油管中的酵母菌轉(zhuǎn)接至YEPD斜面上，30℃條件下培養(yǎng)兩天。（2）一級種子培養(yǎng)：取活化的斜面菌種一環(huán)，接種于裝有5 mL麥汁培養(yǎng)基的試管中，30℃恒溫箱中靜置培養(yǎng)12 h。（3）二級種子培養(yǎng)：取一級種子液2 mL接種到裝有100 mL麥汁培養(yǎng)基的250 mL三角瓶內(nèi)，30℃靜置培養(yǎng)24 h。 黃酒發(fā)酵將30 ml二級種子液接種到加有100 g 大米（煮熟并攤涼）、10 g麥曲、45 mL米漿水和60 mL清水的500 mL直口三角瓶內(nèi)，塞上插有針孔的橡膠塞，置于30℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵6 d。發(fā)酵期間每隔12 h稱重一次，發(fā)酵結(jié)束后測定酒精度、殘?zhí)堑然景l(fā)酵性能及高級醇的含量。3 結(jié)果與討論 BAT1基因敲除對黃酒酵母高級醇生成量的影響 BAT1基因的驗(yàn)證以提取的黃酒酵母基因組為模板，以BAT1U和BAT1D為引物，通過PCR擴(kuò)增出基因片段，電泳結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增產(chǎn)物較單一，特異性條帶大小為1182 bp，與BATI基因大小一致，證明黃酒酵母基因組上存在完整的BAT1基因（圖31）。圖31 BAT1基因的PCR產(chǎn)物 PCR production of BAT1M：DL5000 DNA Marker；1：BAT1 重組質(zhì)粒pUCBABK的構(gòu)建 目的片段的擴(kuò)增以黃酒酵母基因組為模板，利用引物BAU和BAD擴(kuò)增BAT1基因上游的BA片段，利用引物BBU和BBD擴(kuò)增BAT1基因下游的BB片段, 以質(zhì)粒pUG6為模板，利用引物KanU和KanD擴(kuò)增KanMX基因片段，電泳檢測擴(kuò)增片段，結(jié)果如圖32所示。擴(kuò)增出的DNA片段均與預(yù)期大小一致（BA：277 bp；BB：317 bp；KanMX：1613 bp），說明PCR擴(kuò)增結(jié)果都正確。 重組質(zhì)粒的構(gòu)建流程重組質(zhì)粒pUCBABK的構(gòu)建流程如圖33，將純化的BA片段用EcoRI和BamHI進(jìn)行雙酶切，與經(jīng)同樣酶切后的pUC19質(zhì)粒連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUCBA。將純化后的BB片段用BamHI和PstI 進(jìn)行雙酶切，與經(jīng)同樣酶切后的pUCBA連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUCBAB。將KanMX基因片段用BamHI進(jìn)行單酶切，與經(jīng)同樣酶切并去磷酸化回收的pUCBAB質(zhì)粒連接，最終構(gòu)建重組質(zhì)粒pUCBABK。 圖32 BA、BB和KanMX基因片段的PCR產(chǎn)物 PCR product of BA, BB and KanMX fragmentM：DL5000 DNA Marker；1：BA；2：BB；3：KanMX圖33 重組質(zhì)粒pUCBABK的構(gòu)建流程圖 Construction of rebinant plasmid pUCBABK 重組質(zhì)粒的驗(yàn)證根據(jù)重組質(zhì)粒pUCBABK的構(gòu)建流程，分別將重組質(zhì)粒pUCBA、pUCBAB和pUCBABK進(jìn)行酶切驗(yàn)證，電泳結(jié)果如圖34。將重組質(zhì)粒pUCBA經(jīng)EcoRI和BamHI雙酶切，獲得2686 bp和277 bp大小的特異性條帶；將重組質(zhì)粒pUCBAB經(jīng)PstI和BamHI雙酶切，獲得2963 bp和317 bp大小的特異性條帶；將重組質(zhì)粒pUCBABK經(jīng)BamHI單酶切，獲得3280 bp和1613 bp大小的特異性條帶，這些片段大小均與預(yù)期結(jié)果一致，基本證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，然后將質(zhì)粒送往測序公司進(jìn)行基因測序，結(jié)果證明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確，其中KanMX與BA和BB連接方向相反。 圖34 重組質(zhì)粒pUCBA、pUCBAB和pUCBABK的酶切驗(yàn)證 Restriction endonuclease analysis of rebinant plasmids pUCBA, pUCBAB and pUCBABKM：DL5000 DNA marker；1：pUCBA/EcoRIBamHI；2：pUCBAB/PstIBamHI；3：pUCBABK/BamHI BAT1基因敲除突變株的獲得及驗(yàn)證 重組片段的獲得以構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pUCBABK為模板，利用引物BAU和BBD擴(kuò)增2207 bp的重組片段BAKanMXBB，電泳檢測目的片段，結(jié)果如圖35。結(jié)果顯示PCR擴(kuò)增產(chǎn)物單一，特異性條帶大小正確。 圖35重組片段BAKanMXBB的PCR產(chǎn)物 PCR rebinant fragment BAKanMXBBM：DL5000 DNA Marker；1：BAKanMXBB 突變株的獲得及驗(yàn)證將重組片段BAKanMXBB的PCR產(chǎn)物回收，然后通過醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將重組片段分別導(dǎo)入黃酒酵母單倍體RY1a1與RY1α3，通過BA片段和BB片段與酵母染色體上BAT1基因兩側(cè)的同源序列同時(shí)發(fā)生同源重組（圖36），從而整合到酵母染色體上并隨其一起復(fù)制，重組過程實(shí)現(xiàn)了BAT1基因被KanMX基因完全替換，從而實(shí)現(xiàn)BAT1基因的敲除，KanMX基因的引入使突變株產(chǎn)生G418抗性，可以作為篩選標(biāo)記。根據(jù)出發(fā)菌株已知的G418抗性臨界濃度，選用含有600 μg/ml G418抗性的YEPD平板篩選突變株。若基因片段BAKanMXBB已整合到出發(fā)菌株的染色體中，則會在含有600 μg/ml G418抗性的YEPD平板上生長。圖36 BAKanMXBB片段與黃酒酵母基因組同源重組過程 Double homologous rebination between BAKanMXBB cassette and BAT1 gene in yellow wine yeast挑取G418平板上長出的轉(zhuǎn)化子于含有600 μg/mL G418的YEPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并提取其基因組，然后以此基因組DNA作為模板，進(jìn)行PCR驗(yàn)證。根據(jù)釀酒酵母基因組上重組位點(diǎn)兩端的基因序列和插入片段的序列，分別設(shè)計(jì)兩組上下游引物BS和KSBATKXBAT1和BX用以驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子。利用引物BS和KSBAT1可從轉(zhuǎn)化子中擴(kuò)增出大小為1904 bp的上游驗(yàn)證產(chǎn)物（圖37，泳道2），利用引物KXBAT1和BX可從轉(zhuǎn)化子中擴(kuò)增出大小為1188 bp的下游驗(yàn)證產(chǎn)物（圖36，泳道4），而出發(fā)菌株則無擴(kuò)增產(chǎn)物(圖37，泳道1和3)，PCR擴(kuò)增出的產(chǎn)物大小與預(yù)期相同，此結(jié)果說明基因片段BAKanMXBB已經(jīng)成功整合到黃酒酵母染色體BAT1基因位點(diǎn)上，替代敲除了BAT1基因，即BAT1基因敲除單倍體突變株構(gòu)建成功，命名為RY1a1?bat1和RY1α3?bat1。圖37 BAT1基因敲除突變株的PCR驗(yàn)證 PCR confirmation of mutant strain RY1a1?bat1M.：DL5000 DNA marker；1：以RY1a1的基因組為模板，以BS和KSBAT1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物；2：以RY1a1?bat1的基因組為模板，以BS和KSBAT1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物；3：以RY1a1的基因組為模板，以BX和KXBAT1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物；4：以RY1a1?bat1的基因組為模板，以BX和KXBAT1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物 BAT1基因敲除對黃酒酵母高級醇生成量的影響 BAT1基因敲除突變株與出發(fā)菌株基本發(fā)酵性能的比較將構(gòu)建好的BAT1基因敲除突變株RY1a1?batRY1α3?bat1與出發(fā)菌株同時(shí)進(jìn)行黃酒發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵過程中記錄CO2失重情況，發(fā)酵結(jié)束后測量發(fā)酵液中的殘?zhí)呛?，蒸餾發(fā)酵液并測量其酒精含量，結(jié)果見表31所示。表31 BAT1基因敲除突變株與出發(fā)菌株基本發(fā)酵性能的比較Table 31 Basic fermentation performances of BAT1 mutant strains and parent strains菌株CO2累計(jì)失重 （g） 酒度（%，v/v）殘?zhí)牵╣/100 mL）RY1a1RY1α3RY1a1?bat1RY1α3?bat1從表中可以看出，BAT1基因敲除突變株RY1a1?batRY1α3? g，結(jié)果均與出發(fā)菌株接近，同時(shí)殘?zhí)橇恳捕嫉陀? g/100mL，表示BAT1基因敲除突變株與出發(fā)菌株發(fā)酵均很徹底。發(fā)酵結(jié)果說明敲除BAT1基因?qū)S酒酵母基本發(fā)酵性能無明顯影響。 BAT1基因敲除突變株與出發(fā)菌株高級醇生成量的比較BAT1基因敲除突變株與出發(fā)菌株黃酒發(fā)酵結(jié)束后，取發(fā)酵液的蒸餾液進(jìn)行氣相色譜分析，檢測突變株與出發(fā)菌株發(fā)酵產(chǎn)高級醇的含量，結(jié)果見表32。表32 BAT1基因敲除突變株與出發(fā)菌株高級醇生成量比較Table 32 Higher alcohols production of BAT1 mutant strains and parent strains菌株正丙醇（mg/L）異丁醇（mg/L）異戊醇（mg/L）RY1a1RY1α3RY1a1?bat1RY1α3?bat1從表中可以看出，出發(fā)菌株RY1a1產(chǎn)正丙醇、 mg/L、 mg/ mg/L，突變株RY1a1?bat1產(chǎn)正丙醇、 mg/L、 m