【正文】 懸空滴加50～200 μL經65℃水浴預熱的洗脫液，于室溫下放置5 min，然后12000 rpm離心1 min。10）為了增加質粒的回收率，可以將上步離心得到的洗脫液重新滴加到吸附柱中，并在室溫下放置5 min，12000 rpm離心1 min。11）離心管中的液體即為提取的質粒，20℃保存?zhèn)溆谩?質粒載體和目的片段的酶切質粒和目的片段的酶切體系如表27：表27 酶切體系Table 27 Components of enzyme digestion system組分加樣量10Buffer 10 μL質粒≤ 2 μg酶2 μLddH2OAdd to 40 μL反應條件為37℃（或30℃）水浴3~4 h，然后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。 酶切載體的去磷酸化選用牛小腸堿性磷酸酶（Calf Intestine Alkaline Phosphatase，CIAP）對酶切回收后的載體進行去磷酸化處理，如表28，去磷酸化體系按照60 μl標準反應體系進行。表28 去磷酸化體系Table 28 Components of dephosphorylation system組分加樣量10Alkaline Phosphatase Buffer 6 μL質粒 ≤1 μgCIAP（1 U/μL） 2 μLddH2O Add to 60 μL反應條件：先37℃水浴30 min，然后再50℃水浴30 min。將去磷酸化后的產物按照PCR產物純化回收的步驟進行回收，然后置于20℃保存。 質粒載體與目的片段的連接 質粒載體與目的片段進行連接的體系見表29：表29 連接體系Table 29 Components of ligation system組分加樣量載體DNAx μL目的片段y μLSolution I5 μL反應條件：載體與目的片段的摩爾比為1:31:10，16℃恒溫條件下連接過夜。 酵母轉化酵母醋酸鋰轉化法[7879]的主要操作步驟如下：（1）酵母感受態(tài)的制備1）取斜面酵母菌種一環(huán)于5 mL YEPD液體培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)過夜。2）將上述過夜培養(yǎng)的菌液接種至裝有50 mL YEPD液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)至細胞濃度為2107個/mL（3～5 h），此時菌體處于對數期。3）將菌液轉至50 mL無菌離心管中，5000 rpm離心5 min，棄除上清液，再用25 mL無菌水洗滌兩次，并棄去上清；4）用1 mL mol/L的LiAc緩沖液重新懸浮酵母菌體， mL的EP管中。5）離心，棄除上清， mL的LiAc/TE緩沖液重新懸浮，每管50 μL進行分裝，離心后，用移液槍小心吸除上清，并立即進行轉化。（2）轉化1）將1 mL鮭魚精DNA煮沸5 min，并快速在冰上冷卻。2）對于每一個轉化，都要小心按下列順序加入“轉化混合液”：PEG3350（50% m/v） 240 μL mol/L乙酸鋰 36 μLssDNA（ mg/mL） 50 μL轉化片段（～10 μg） 34 μL3）劇烈振蕩直到完全混勻。4）30℃恒溫箱中保溫30 min。5）42℃水浴中熱激40 min。6）13000 rpm離心30 s，去除上層轉化液，然后加入1 ml YEPD重新懸浮菌體，30℃100 rpm振蕩培養(yǎng)4 h。7）離心去除上清液，用200～500 μL無菌水重新懸浮菌體，然后取適量菌液涂布G418抗性YEPD平板，培養(yǎng)2~3 d后挑取能夠正常生長的轉化子。 G418抗性基因的去除本研究擬采用CreLoxP報告基因挽救系統(tǒng)[8081]，來剔除報告基因KanMX。首先利用醋酸鋰轉化法將重組質粒pGAPza轉入酵母中，然后通過半乳糖誘導后，稀釋涂布于無抗性的YEPD平板。待培養(yǎng)出單菌落之后，將單菌落對應點接到無抗性的YEPD平板和含有G418抗性的YEPD平板上，置于30℃恒溫條件下培養(yǎng)2~4 d，挑取在無抗性YEPD平板上生長而在含G418抗性平板上不生長的菌落進行PCR擴增，然后進行瓊脂糖凝膠電泳，驗證轉化子的KanMX基因是否去除。 黃酒發(fā)酵實驗 種子培養(yǎng)（1）菌種活化：取保存于甘油管中的酵母菌轉接至YEPD斜面上，30℃條件下培養(yǎng)兩天。（2）一級種子培養(yǎng)：取活化的斜面菌種一環(huán)，接種于裝有5 mL麥汁培養(yǎng)基的試管中，30℃恒溫箱中靜置培養(yǎng)12 h。（3）二級種子培養(yǎng)：取一級種子液2 mL接種到裝有100 mL麥汁培養(yǎng)基的250 mL三角瓶內，30℃靜置培養(yǎng)24 h。 黃酒發(fā)酵將30 ml二級種子液接種到加有100 g 大米（煮熟并攤涼）、10 g麥曲、45 mL米漿水和60 mL清水的500 mL直口三角瓶內，塞上插有針孔的橡膠塞，置于30℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵6 d。發(fā)酵期間每隔12 h稱重一次，發(fā)酵結束后測定酒精度、殘?zhí)堑然景l(fā)酵性能及高級醇的含量。3 結果與討論 BAT1基因敲除對黃酒酵母高級醇生成量的影響 BAT1基因的驗證以提取的黃酒酵母基因組為模板，以BAT1U和BAT1D為引物，通過PCR擴增出基因片段，電泳結果顯示PCR擴增產物較單一，特異性條帶大小為1182 bp，與BATI基因大小一致，證明黃酒酵母基因組上存在完整的BAT1基因（圖31）。圖31 BAT1基因的PCR產物 PCR production of BAT1M：DL5000 DNA Marker；1：BAT1 重組質粒pUCBABK的構建 目的片段的擴增以黃酒酵母基因組為模板，利用引物BAU和BAD擴增BAT1基因上游的BA片段，利用引物BBU和BBD擴增BAT1基因下游的BB片段, 以質粒pUG6為模板，利用引物KanU和KanD擴增KanMX基因片段，電泳檢測擴增片段，結果如圖32所示。擴增出的DNA片段均與預期大小一致（BA：277 bp；BB：317 bp；KanMX：1613 bp），說明PCR擴增結果都正確。 重組質粒的構建流程重組質粒pUCBABK的構建流程如圖33，將純化的BA片段用EcoRI和BamHI進行雙酶切，與經同樣酶切后的pUC19質粒連接，構建重組質粒pUCBA。將純化后的BB片段用BamHI和PstI 進行雙酶切，與經同樣酶切后的pUCBA連接，構建重組質粒pUCBAB。將KanMX基因片段用BamHI進行單酶切，與經同樣酶切并去磷酸化回收的pUCBAB質粒連接，最終構建重組質粒pUCBABK。 圖32 BA、BB和KanMX基因片段的PCR產物 PCR product of BA, BB and KanMX fragmentM：DL5000 DNA Marker；1：BA；2：BB；3：KanMX圖33 重組質粒pUCBABK的構建流程圖 Construction of rebinant plasmid pUCBABK 重組質粒的驗證根據重組質粒pUCBABK的構建流程，分別將重組質粒pUCBA、pUCBAB和pUCBABK進行酶切驗證，電泳結果如圖34。將重組質粒pUCBA經EcoRI和BamHI雙酶切，獲得2686 bp和277 bp大小的特異性條帶；將重組質粒pUCBAB經PstI和BamHI雙酶切，獲得2963 bp和317 bp大小的特異性條帶；將重組質粒pUCBABK經BamHI單酶切，獲得3280 bp和1613 bp大小的特異性條帶，這些片段大小均與預期結果一致，基本證明重組質粒構建成功，然后將質粒送往測序公司進行基因測序，結果證明重組質粒構建正確，其中KanMX與BA和BB連接方向相反。 圖34 重組質粒pUCBA、pUCBAB和pUCBABK的酶切驗證 Restriction endonuclease analysis of rebinant plasmids pUCBA, pUCBAB and pUCBABKM：DL5000 DNA marker；1：pUCBA/EcoRIBamHI；2：pUCBAB/PstIBamHI；3：pUCBABK/BamHI BAT1基因敲除突變株的獲得及驗證 重組片段的獲得以構建好的重組質粒pUCBABK為模板，利用引物BAU和BBD擴增2207 bp的重組片段BAKanMXBB，電泳檢測目的片段，結果如圖35。結果顯示PCR擴增產物單一，特異性條帶大小正確。 圖35重組片段BAKanMXBB的PCR產物 PCR rebinant fragment BAKanMXBBM：DL5000 DNA Marker；1：BAKanMXBB 突變株的獲得及驗證將重組片段BAKanMXBB的PCR產物回收，然后通過醋酸鋰轉化法將重組片段分別導入黃酒酵母單倍體RY1a1與RY1α3，通過BA片段和BB片段與酵母染色體上BAT1基因兩側的同源序列同時發(fā)生同源重組（圖36），從而整合到酵母染色體上并隨其一起復制，重組過程實現(xiàn)了BAT1基因被KanMX基因完全替換，從而實現(xiàn)BAT1基因的敲除，KanMX基因的引入使突變株產生G418抗性，可以作為篩選標記。根據出發(fā)菌株已知的G418抗性臨界濃度，選用含有600 μg/ml G418抗性的YEPD平板篩選突變株。若基因片段BAKanMXBB已整合到出發(fā)菌株的染色體中，則會在含有600 μg/ml G418抗性的YEPD平板上生長。圖36 BAKanMXBB片段與黃酒酵母基因組同源重組過程 Double homologous rebination between BAKanMXBB cassette and BAT1 gene in yellow wine yeast挑取G418平板上長出的轉化子于含有600 μg/mL G418的YEPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并提取其基因組，然后以此基因組DNA作為模板，進行PCR驗證。根據釀酒酵母基因組上重組位點兩端的基因序列和插入片段的序列，分別設計兩組上下游引物BS和KSBATKXBAT1和BX用以驗證轉化子。利用引物BS和KSBAT1可從轉化子中擴增出大小為1904 bp的上游驗證產物（圖37，泳道2），利用引物KXBAT1和BX可從轉化子中擴增出大小為1188 bp的下游驗證產物（圖36，泳道4），而出發(fā)菌株則無擴增產物(圖37，泳道1和3)，PCR擴增出的產物大小與預期相同，此結果說明基因片段BAKanMXBB已經成功整合到黃酒酵母染色體BAT1基因位點上，替代敲除了BAT1基因，即BAT1基因敲除單倍體突變株構建成功，命名為RY1a1?bat1和RY1α3?bat1。圖37 BAT1基因敲除突變株的PCR驗證 PCR confirmation of mutant strain RY1a1?bat1M.：DL5000 DNA marker；1：以RY1a1的基因組為模板，以BS和KSBAT1為引物進行PCR擴增的產物；2：以RY1a1?bat1的基因組為模板，以BS和KSBAT1為引物進行PCR擴增的產物；3：以RY1a1的基因組為模板，以BX和KXBAT1為引物進行PCR擴增的產物；4：以RY1a1?bat1的基因組為模板，以BX和KXBAT1為引物進行PCR擴增的產物 BAT1基因敲除對黃酒酵母高級醇生成量的影響 BAT1基因敲除突變株與出發(fā)菌株基本發(fā)酵性能的比較將構建好的BAT1基因敲除突變株RY1a1?batRY1α3?bat1與出發(fā)菌株同時進行黃酒發(fā)酵實驗，發(fā)酵過程中記錄CO2失重情況，發(fā)酵結束后測量發(fā)酵液中的殘?zhí)呛?，蒸餾發(fā)酵液并測量其酒精含量，結果見表31所示。表31 BAT1基因敲除突變株與出發(fā)菌株基本發(fā)酵性能的比較Table 31 Basic fermentation performances of BAT1 mutant strains and parent strains菌株CO2累計失重 （g） 酒度（%，v/v）殘?zhí)牵╣/100 mL）RY1a1RY1α3RY1a1?bat1RY1α3?bat1從表中可以看出，BAT1基因敲除突變株RY1a1?batRY1α3? g，結果均與出發(fā)菌株接近，同時殘?zhí)橇恳捕嫉陀? g/100mL，表示BAT1基因敲除突變株與出發(fā)菌株發(fā)酵均很徹底。發(fā)酵結果說明敲除BAT1基因對黃酒酵母基本發(fā)酵性能無明顯影響。 BAT1基因敲除突變株與出發(fā)菌株高級醇生成量的比較BAT1基因敲除突變株與出發(fā)菌株黃酒發(fā)酵結束后，取發(fā)酵液的蒸餾液進行氣相色譜分析，檢測突變株與出發(fā)菌株發(fā)酵產高級醇的含量，結果見表32。表32 BAT1基因敲除突變株與出發(fā)菌株高級醇生成量比較Table 32 Higher alcohols production of BAT1 mutant strains and parent strains菌株正丙醇（mg/L）異丁醇（mg/L）異戊醇（mg/L）RY1a1RY1α3RY1a1?bat1RY1α3?bat1從表中可以看出，出發(fā)菌株RY1a1產正丙醇、 mg/L、 mg/ mg/L，突變株RY1a1?bat1產正丙醇、 mg/L、 m