小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)-資料下載頁
2025-06-22 21:03本頁面
【正文】 10天，根據(jù)需要更換培養(yǎng)基－－大約每隔一天。觀察細(xì)胞形態(tài)，神經(jīng)樣細(xì)胞大約出現(xiàn)在第4到第7天。當(dāng)神經(jīng)樣細(xì)胞能夠被鑒別時(shí)，轉(zhuǎn)入到第4步。步驟的轉(zhuǎn)換應(yīng)該在神經(jīng)前體細(xì)胞出現(xiàn)第一個(gè)清晰的標(biāo)志幾天以后，通常是在第3步的第6到第10天。第4步－N3培養(yǎng)基＋bFGF通過將神經(jīng)前體細(xì)胞培養(yǎng)在含有10ng/ml bFGF的培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增。，加入12ml 胰酶2．37℃孵育5分鐘3．用4mlEB培養(yǎng)基終止胰酶活性，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入錐形管中放置3～5分鐘移出細(xì)胞團(tuán)，將上清移入一新的離心管離心。4．將細(xì)胞重懸于含有bFGF的N3培養(yǎng)基。5．將細(xì)胞接種在包被多聚L鳥氨酸/纖維連接蛋白的蓋玻片上（最好將蓋玻片放于24孔培養(yǎng)板或6孔培養(yǎng)板，6孔培養(yǎng)板中每孔放置5個(gè)蓋玻片如果是塑料的放置4個(gè)，以使最大可能的獲得樣品數(shù)量）。105/106/孔。6．2天后更換培養(yǎng)基第5步－N3培養(yǎng)基通過撤除bFGF使神經(jīng)前體細(xì)胞分化1．細(xì)胞被接種在蓋玻片上4天后將培養(yǎng)基換成不含bFGF的N3培養(yǎng)基2．根據(jù)需要換液（大約每隔一天）3．分化10～15天后固定細(xì)胞移除培養(yǎng)基PBS洗滌加入4%福爾馬林室溫放置30分鐘PBS洗滌2次儲(chǔ)存于PBS。％疊氮化納的PBS移植細(xì)胞的準(zhǔn)備細(xì)胞在胚狀體形成4天以后被移植（相應(yīng)于體外分化過程中的第2步末細(xì)胞被轉(zhuǎn)種到組織培養(yǎng)板）。正如在前文體外分化中所描述的在移植之前4天開始形成胚狀體。通常再需要一天時(shí)間以便將胚狀體移植入一10cm的培養(yǎng)皿。移植1．將胚狀體轉(zhuǎn)移至一15ml 圓錐形管中放置3～5分鐘使胚狀體沉降下來。細(xì)胞被離心3分鐘會(huì)更好。放置使之沉降將會(huì)去除更多的單個(gè)細(xì)胞（包括死細(xì)胞）而這些細(xì)胞可以被離心下來。2．去除上清將胚狀體重懸于無鈣鎂離子的1PBS中3．離心3分鐘4．去除上清加入1胰酶（10cm的培養(yǎng)皿加1ml）5．37℃水浴5分鐘6．加入5mlEB培養(yǎng)基小心吹打約10次小心處理細(xì)胞很重要，進(jìn)行細(xì)胞傳代分散細(xì)胞時(shí)不可劇烈吹打。7．離心2分鐘8．吸出上清將細(xì)胞重懸于500μl EB培養(yǎng)基9．用光滑的巴斯德吸管小心吹打5次10．離心2次11．吸出上清將細(xì)胞重懸于100μl EB培養(yǎng)基煙酸己可堿標(biāo)記ES細(xì)胞進(jìn)行移植1．準(zhǔn)備一10μg/ml的煙酸已可堿染液（雙苯酰亞胺，在冷凍室118）2．加入1mg（你能稱到的最小量）到5ml EB培養(yǎng)基（制成200μg/ml）3．將溶液稀釋成10μg/ml （100μl 200μg/ml EB培養(yǎng)基）4．如前所述將細(xì)胞重懸于2ml煙酸已可堿染液而不是EB培養(yǎng)基中制備ES細(xì)胞懸液，5．將懸液置于室溫（或冰上）30分鐘6．離心2分鐘7．吸出上清將細(xì)胞重懸于2ml EB培養(yǎng)基8．重復(fù)一次9．離心2分鐘10．吸出上清將細(xì)胞重懸于100μl EB培養(yǎng)基并置于冰上。 6
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