20xx年醫(yī)學(xué)專題—第七章哺乳動物胚胎干細(xì)胞技術(shù)-資料下載頁
2024-11-16 00:29本頁面
【正文】 胞或癌細(xì)胞做對照，用專用試劑盒檢測。 4.Apase（堿性磷酸酶）：可通過組織化學(xué)方法鑒定，細(xì)胞經(jīng)乙醇或病痛甲醛固定后，直接加入底物，即可鑒定Apase的表達(dá)水平，都應(yīng)該為陽性。 5.核型分析：傳到2~5代時需要進(jìn)行核型分析，分析時先在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入一定濃度的秋水酰胺，使細(xì)胞同步在M期，然后用低滲溶液處理，經(jīng)乙醇冰醋酸溶液固定后染色和顯微照相，最后進(jìn)行核型分析，檢測細(xì)胞是否維持在二倍體狀態(tài)。,第五十六頁，共七十頁。,6.發(fā)育分化潛力： （1）體外誘導(dǎo)分化：是把ES細(xì)胞培養(yǎng)在無分化抑制物的普通培養(yǎng)液中，如果ES細(xì)胞能自動聚合并分化形成胚狀體，可初步確認(rèn)具有發(fā)育多能性； （2）畸胎瘤實驗：把ES細(xì)胞注射到有免疫(miǎny236。)缺陷成年小鼠或遺傳同質(zhì)動物的皮下或腎臟、睪丸的被膜下，如果能形成畸胎瘤，可初步判定為細(xì)胞具有多能性。,第五十七頁，共七十頁。,（3）嵌合體實驗：把培養(yǎng)的ES細(xì)胞與早期胚胎的卵裂球聚合，或直接把ES細(xì)胞注入囊胚腔，然后讓重組胚在體內(nèi)繼續(xù)發(fā)育，通過檢測后代的嵌合狀況，分析ES細(xì)胞的分化潛力。只有當(dāng)操作后的胚胎發(fā)育為嵌合體，注入的細(xì)胞能分化為內(nèi)、中和外三胚層細(xì)胞，并參與細(xì)胞生殖干細(xì)胞形成時，才能確認(rèn)為ES細(xì)胞。 目前(m249。qi225。n)，只有小鼠、猴和人能到達(dá)以上指標(biāo)。,第五十八頁，共七十頁。,1 如何維持體外擴(kuò)增時不分化？ 2 分化細(xì)胞的增殖是一個瓶頸問題：數(shù)量和純度 3 如何定向誘導(dǎo)干細(xì)胞的分化？明確干細(xì)胞發(fā)育的調(diào)控機(jī)制 4 胚胎干細(xì)胞真正用于器官克隆與移植仍需要技術(shù)上的突破 5 如何克服移植排斥問題？破壞或改變細(xì)胞許多基因的可行性，核移植是否激活卵細(xì)胞的沉默基因，是否改變?nèi)旧w結(jié)構(gòu)？ 6 胚胎干細(xì)胞的安全性如何？畸胎瘤，腫瘤(zhǒngli)形成？ 7 倫理之爭,七.ES細(xì)胞技術(shù)目前(m249。qi225。n)存在的問題,第五十九頁，共七十頁。,1.ES細(xì)胞系的分裂效率低 主要原因是缺乏理想的分離培養(yǎng)體系(tǐx236。)，目前對于ES干細(xì)胞維持多能性的分子機(jī)理缺乏了解，不能根據(jù)細(xì)胞分化特點和維持不分化的營養(yǎng)要求，建立合理的培養(yǎng)體系，是目前存在的主要問題。 2.ES細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的理論和技術(shù)水平低 目前的技術(shù)還無法對ES細(xì)胞實施專一的誘導(dǎo)分化，即分化為特定的細(xì)胞類型，如神經(jīng)或心肌細(xì)胞等。,第六十頁，共七十頁。,3.ES細(xì)胞治療中面臨的免疫排斥和致癌問題 外源的ES細(xì)胞移入病人機(jī)體后，細(xì)胞表面(biǎomi224。n)的組織相容性抗原將激活免疫系統(tǒng)，出現(xiàn)排斥反應(yīng)，導(dǎo)致移植失敗。 目前關(guān)于這方面的機(jī)理研究較少，克服排異反應(yīng)的技術(shù)還不具備。,第六十一頁，共七十頁。,4.ES細(xì)胞目前無法培育出完整(w225。nzhěng)的器官 5.人ES細(xì)胞分離培養(yǎng)面臨的倫理法律問題 獲得ES細(xì)胞，必須毀壞人的早期胚胎或胎兒，與宗教的教義和社會倫理相違背，同時還違反國家法律，所以公眾很難接受。,第六十二頁，共七十頁。,八.ES細(xì)胞(x236。bāo)技術(shù)的發(fā)展方向,1. ES細(xì)胞維持自我更新和定向分化的分子機(jī)理 2. ES細(xì)胞治療技術(shù)的研究 用ES細(xì)胞修復(fù)病變或創(chuàng)傷組織將會引起一場醫(yī)學(xué)革命，如何將兩者結(jié)合(ji233。h233。)起來非常復(fù)雜。,第六十三頁，共七十頁。,3. ES細(xì)胞作為工具探討基因功能和個體的發(fā)生發(fā)育 隨著人和其他哺乳動物的基因組計劃完成后，基因的表達(dá)調(diào)控規(guī)律和在生命活動中的功能研究迫在眉睫。 應(yīng)用嵌合體技術(shù)，以特殊基因標(biāo)記的ES細(xì)胞作為探針，研究未知基因的功能，探討器官的發(fā)生、發(fā)育規(guī)律，將是醫(yī)學(xué)、動物科學(xué)和發(fā)育生物學(xué)研究的前沿(qi225。ny225。n)領(lǐng)域。,第六十四頁，共七十頁。,4. ES細(xì)胞治療(zh236。li225。o)中的免疫排斥問題,第六十五頁，共七十頁。,5.治療型克隆技術(shù)：用病人的正常細(xì)胞作為核供體，通過細(xì)胞核移植方法獲得囊胚，然后分離培養(yǎng)ES細(xì)胞，再用ES細(xì)胞修復(fù)衰老或功能異常的器官、組織。但是人細(xì)胞核移植技術(shù)研究在很多國家(gu243。jiā)是被禁止的，所以這類研究比較困難。,第六十六頁，共七十頁。,第六十七頁，共七十頁。,6.用ES細(xì)胞生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因家畜 ES細(xì)胞易于(y236。y)基因打靶和基因敲除，用遺傳改良后的ES細(xì)胞，通過細(xì)胞核移植技術(shù)，生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因后代，將是提高轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)效率的有效方法。,第六十八頁，共七十頁。,The end,第六十九頁，共七十頁。,內(nèi)容(n232。ir243。ng)總結(jié),韓 雪 蕾。用外源基因轉(zhuǎn)染后，篩選陽性細(xì)胞，然后注入到囊胚腔或其他卵裂球聚合獲得嵌合體后代，用轉(zhuǎn)染的ES細(xì)胞分化為生殖干細(xì)胞，生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因陽性動物。從胚泡中分離出細(xì)胞團(tuán)的方法主要免疫外科學(xué)方法，顯微外科學(xué)方法和組織培養(yǎng)法等。其中組織培養(yǎng)法是將胚泡接種在飼養(yǎng)層上，模擬體內(nèi)胚泡的著床，更接近自然發(fā)育過程，較易獲得胚胎干細(xì)胞集落。2.冷凍保存：通過超低溫冷凍保存使細(xì)胞的代謝活動完全停止(t237。ngzhǐ)，達(dá)到長期保存的目的,第七十頁，共七
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