小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)-預(yù)覽頁
【正文】 0mM）β巰基乙醇（55Mm）LIF凍存細(xì)胞凍存液90％HS和10％DMSO步驟：1．1PBS洗細(xì)胞并留少許PBS在培養(yǎng)皿內(nèi)；2．用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞；3．將細(xì)胞轉(zhuǎn)入15ml 離心管管內(nèi)并離心3分鐘；4．棄去上清并將細(xì)胞重懸于冷的凍存液中（10 cm的培養(yǎng)皿用2ml，15cm的培養(yǎng)皿用6－7ml。包被培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿1．加入足量的明膠溶液覆蓋培養(yǎng)平面（15 cm培養(yǎng)皿加2ml，10 ～1 ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆蓋培養(yǎng)表面就行了。1．去除培養(yǎng)液；2．無鈣鎂PBS（Gibco）洗滌；3．加入胰酶EDTA（Gibco）。ES細(xì)胞有聚集成團(tuán)的傾向，傳代過程中仔細(xì)將細(xì)胞弄散分開很重要。當(dāng)你使用不同規(guī)格的培養(yǎng)板進(jìn)行細(xì)胞傳代可以使用表1來計算傳代比率。一般體外誘導(dǎo)向神經(jīng)細(xì)胞方向分化，也可以采用低濃度的RA進(jìn)行誘導(dǎo)。將21ml該溶液和50ml FBS加入450mlDMEM中制備培養(yǎng)基。DMEM（高糖）L谷氨酰胺（200mM）HEPES（1M）PEST（P104U/mlS104μg/ml將該溶液加入DMEM/F12中制備培養(yǎng)基，貯存于4℃。ITSFn ａnd N3培養(yǎng)基貯存液的準(zhǔn)備使用無菌的溶劑和稀釋液，在分裝之前要對溶液進(jìn)行過濾，如果因為某些原因溶液在分裝之前沒有進(jìn)行過濾，需要在管子上標(biāo)明以便別人在使用時知道該溶液不能直接用于細(xì)胞培養(yǎng)。包被過程：1．加入多聚L賴氨酸，至少2－3小時（過夜也行）2．吸出多聚L賴氨酸3．加入纖維結(jié)合蛋白，大約1－2小時4．吸出纖維結(jié)合蛋白，放置30分鐘晾干5．貯存在4℃24孔板用200μl，6孔板用500μl。1．分散純化細(xì)胞（參見上面的細(xì)胞傳代部分）2．純化2小時后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入含有ES培養(yǎng)基的50ml Falcon管中，計數(shù)細(xì)胞取適量體積放入15ml管中離心3分鐘。6．用EB培養(yǎng)基培養(yǎng)的第4天將細(xì)胞轉(zhuǎn)入沒有包被的組織培養(yǎng)皿中（這即是細(xì)胞的移植步驟）。這一天被認(rèn)為是第2步和第3步的分界。當(dāng)神經(jīng)樣細(xì)胞能夠被鑒別時，轉(zhuǎn)入到第4步。4．將細(xì)胞重懸于含有bFGF的N3培養(yǎng)基。％疊氮化納的PBS移植細(xì)胞的準(zhǔn)備細(xì)胞在胚狀體形成4天以后被移植（相應(yīng)于體外分化過程中的第2步末細(xì)胞被轉(zhuǎn)種到組織培養(yǎng)板）。細(xì)胞被離心3分鐘會更好。 6
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