【正文】 分析其原因可能是由于其變性所導致的。通過Sephadex G100柱層析，雜蛋白和轉谷氨酰胺酶進一步得到分離。實驗中收集第6078管的酶液合并，作為下一步實驗的供試液。 轉谷氨酰胺酶SDSPAGE檢測用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢驗純度后，結果如圖36所示。經過電泳后，粗酶存在多個條帶，并且條帶并不清晰，說明所購買的粗酶中還存在其他的雜蛋白，純化后的酶液有一條單一區(qū)帶，與相對分子質量標準對照，谷氨酰胺轉胺酶相對分子質量約為38 000， SDSPAGE試驗證明，本試驗所采用的純化工藝對純化谷氨酰胺轉胺酶效果比較理想，最終獲得純度較高的轉谷氨酰胺酶。圖36 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 轉谷氨酰胺酶比活的測定結果通過測定粗酶和各個步驟純化后酶的總酶活和總蛋白的值，進而計算得出其比活值。表31 轉谷氨酰胺酶分離純化結果純化步驟總酶活/U總蛋白/mg比活力/Umg1純化倍數回收率/%粗酶1100硫酸銨鹽析超濾濃縮凝膠層析由表31可見，粗提液經硫酸銨分級沉淀后，這個結果證實55%硫酸按飽和度分級沉淀對轉谷氨酰胺酶的初步純化有較好的效果，可以去除部分雜蛋白，而最大限度地保留酶蛋白。經過超濾后，說明通過超濾截留了一小部分雜蛋白。通過SepharoseG100柱層析能進一步排除絕大部分雜蛋白，使樣品得以進一步純化，效果較好。 轉谷氨酰胺酶性質研究結果 酶的最適反應溫度和熱穩(wěn)定性由圖37所示，轉谷氨酰胺酶的最適反應溫度為40℃，此時酶活性最高，但是當溫度保持在37℃～45℃之間時，其酶活性相差不大。由圖38所示，在溫度范圍35℃～45℃之間較為穩(wěn)定，酶活性隨著溫度降低的速率比隨溫度上升的速率要慢，可知當溫度升高時，酶活性下降的速率較快。圖37 酶最適反應溫度 圖38 酶的熱穩(wěn)定性綜合酶的最適反應溫度和熱穩(wěn)定性來看，若想在實際生產中使轉谷氨酰胺酶能最大限度的發(fā)揮其活性，并保持有一定的熱穩(wěn)定性，應該將其溫度控制在37℃～45℃之間，再從實際節(jié)約成本的角度分析，可將溫度控制在37℃左右，即可以保證轉谷氨酰胺的活性和穩(wěn)定性，又能提高一定的經濟效益。 酶的最適pH和pH穩(wěn)定性由圖39所示，在pH6左右該酶具有最大活力，當再將pH調高一些達到7時，對活性的影響不大。由圖310所示，該酶在pH5～7左右最為穩(wěn)定，其相對酶活基本沒有太大的變化。綜合酶的最適pH和pH穩(wěn)定性可知，該酶比較適合偏酸性的環(huán)境，將pH跳到6～7時，有助于酶發(fā)揮其活性和保證其穩(wěn)定性。圖39 pH對酶活的影響 圖310 酶的pH穩(wěn)定性 金屬離子對酶活影響由圖311各種金屬離子對酶活的影響可知，Ca2+、Mg2+、Ba2+對MTG的活性幾乎沒有影響，而Fe3+、Zn2+ 、Cu2+抑制酶活，其中Fe3+對其活性的影響最大。由此可得出在該酶的實際應用中，可盡量避免混入Fe3+，以及Zn2+ 和Cu2+，所使用的生產、儲藏以及輸送的設備應該考慮使用不銹鋼材料，避免使用鐵質材料，以發(fā)揮酶的最大活性。圖311 各種金屬離子對酶活的影響結 論轉谷氨酰胺酶通過硫酸銨分級沉淀，超濾脫鹽，聚乙二醇濃縮， SepharoseG100凝膠過濾柱層析進行分離純化，最后經SDSPAGE檢驗蛋白純度，所得到的結論如下：轉谷氨酰胺酶經過硫酸銨分級沉淀后，，，%。轉谷氨酰胺酶經過超濾脫鹽及聚乙二醇濃縮后，，，%。轉谷氨酰胺酶經過Sephadex G100凝膠過濾柱層析后，，，%。轉谷氨酰胺酶經SDSPAGE檢驗蛋白純度，得到單一區(qū)帶，說明分離純化的效果較好，并得出的相對分子質量為38 000左右。對轉谷氨酰胺酶的酶學性質進行研究，得到結論如下：轉谷氨酰胺酶的最適反應溫度為40℃左右，溫度穩(wěn)定范圍為35℃～45℃，但綜合考慮其最佳的應用溫度為37℃?！?，得出該酶更適合在偏酸性或中性的環(huán)境，～Ca2+、Mg2+、Ba2+對MTG的活性幾乎沒有影響，而Fe3+、Zn2+ 、Cu2+抑制酶活，其中Fe3+對其活性的影響最大。由此可得出在實際的操作過程中，應該選用對轉谷氨酰胺酶最佳的反應條件，避免混入可能抑制酶活性的離子，從而使其能最大的發(fā)揮其活性。參考文獻1 Ando H，Adachi M，Umeda K，et al．Purification and characterization of a novel transglutaminase derived from microorganism[J]． Agric Biol Chem．1989，53：2613～26172 周楠迪，陳堅，鄭美英等． 谷氨酰胺轉胺酶的功能性質及其在食品中的應用方法[J]．中國食品添加劑．2000，1：54～583 柏映國，燕國梁．Streptomyces hygroscopicus　產谷氨酰胺轉氨酶搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化［J］．食品與發(fā)酵工業(yè)．2004(2)：27~324 王璋，王灼維等．微生物轉谷氨酰胺酶生產菌的“神州四號”飛船搭載育種研究[J]．食品與發(fā)酵工業(yè)．2004(1)：6～125 Gerber U，Jucknischke U，Putzien S，et al．A rapid and simple met hod for the purification of transglutaminase from Streptoverticillium mobaraense[J]．Biochem J．1994，299：825～829 6 常中義，江波等．微生谷氨酰胺轉氨酶的應用進展[J]．食品科學．2002，21(9)：6～77 鄭美英，陳堅等．谷氨酰胺轉氨酶－理化性質、生產方法及其在食品工業(yè)中的應用[J]．生物工程進程．2001，21，(1)：33～378 Y Zhu．Microbial transglutaminasea review of its production and　application infood processing[J]．Appl Micrbiol Biotechol．1995，44：277~2829 寇明鈺，趙國華，闞健全．谷氨酰胺轉氨酶及其在食品工業(yè)中的作用[J]．中國食品添加劑．2004，5 ：81～8810 王穩(wěn)航．谷氨酰胺轉氨酶在畜產加工中的應用[J]．肉類工業(yè)．2002，8：28～3111 梁海燕，馬儷珍．谷氨酰胺轉氨酶在肉制品加工中的應用[J]．肉類研究．2004，1：50～5212 林加涵，魏文鈴等．現代生物學實驗（下冊）[M]．北京：高等教育出版社，2001： 36～4013 O’Sullivan M．M．，Lorenzen P．C．，O’Connell J．E．，et al．Short Communication：Influence of Transglutaminase on the Heat Stability of Milk，［J］．Dairy Sci．2001，84：1331～133414 O’Sullivan M．M．，Kelly A．L．，and Fox P．F．Effect of　Transglutaminase on the Heat Stabilit y of Milk：a Possible Mechanism，［J］．Dairy Sci．2002，85：1～715 程國華．生物化學實驗技術［M］．沈陽：沈陽農業(yè)大學出版社，1998．11～1416 王灼維，王璋．土壤分離轉谷氨酰胺酶生產菌株[J]．食品與發(fā)酵工業(yè)．2004（4）：5～917 Suzuki S，Izawa Y，Kobayashi K，et al．Purification and characterization of novel transglutaminase from Bacillussubtilis spores[J]．Biosci Biotechnol Biochem．2000，64：2344～235118 何忠效．電泳[M]．北京：科學出版社．1999．129～139致　　謝感謝我的導師馬永強老師的指導，從選題、定題、方案的設計開始，一直到最后論文的反復修改、潤色，馬老師始終認真負責地給予我深刻而細致地指導，幫助我開拓研究思路，精心點撥、熱忱鼓勵。還要感謝王強學長在實驗期間對我的幫助，使得我的畢業(yè)論文才能夠得以順利完成，謝謝王強學長，以及所有幫助過我的老師和同學。 同時感謝百忙之中抽時間對本文進行審閱、評議和參加本人論文答辯的各位師長！希望我的畢業(yè)論文為我的大學生活畫下一個完美的句號，謝謝