【正文】 洗滌沉淀。離心12000 rpm，5 min，4℃。：棄去上清，室溫干燥2~5 min。：用30 μl DEPC水溶解沉淀。：用分光光度計(jì)測量RNA濃度。：RNA濃度高于100ng/μl，OD260/，可直接用于后續(xù)RTPCR實(shí)驗(yàn),否則需重新抽提。：若抽提好的RNA暫時不用，可置于80℃保存?zhèn)溆?。：所有用過的移液器調(diào)至最大量程，擺放整齊，所有用過的東西歸回原位。最后用75%酒精噴灑實(shí)驗(yàn)臺面，2 min后擦拭干凈。：使用組織提取RNA時組織必須新鮮，否則RNA便容易被內(nèi)源性的RNA酶降解；所有的試劑、耗材均無RNA酶、無菌，如果發(fā)現(xiàn)試劑有可能被污染，要立即更換；吸取上清時一定要小心，不要吸到中間層的蛋白，一定要少吸，不要貪多，以免造成RNA樣品被蛋白或基因組DNA污染。題目：反轉(zhuǎn)錄標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程起草： 日期：審核：日期：編號： JSLJSOP0007000批準(zhǔn)：日期：頒發(fā)部門：技術(shù)部生效日期：分發(fā)部門：技術(shù)部反轉(zhuǎn)錄標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程1. 目的：將抽提好的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，作為Realtime PCR反應(yīng)模板以檢測目的基因的表達(dá)情況。2. 適用范圍：無降解，分光光度計(jì)檢測濃度大于100ng/μl，OD260/。3. 方法原理：以RNA為模板合成DNA的過程，需逆轉(zhuǎn)錄酶的催化。其過程先以經(jīng)剪切作用除去內(nèi)含子的成熟mRNA為模板，合成RNA/DNA雜化雙鏈，然后水解RNA鏈，再以剩下的DNA單鏈為模板合成DNA雙鏈。4. 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：冰塊，保溫盒，水浴鍋. 試劑：RTMix,RT引物；DEPC水。注：逆轉(zhuǎn)錄所需試劑使用前需從冰箱中取出置于冰上融化，混勻后備用。. 設(shè)備：八連管、10μl和200μl槍頭（RNA free），恒溫水浴鍋，PCR儀（ABI 9700），10μl、20μl和100μl移液槍。. 樣本確認(rèn)：Total RNA必須濃度大于100ng/μl，OD260/。5. 實(shí)驗(yàn)步驟：. 試劑準(zhǔn)備： 將樣品，RTMix,RT引物從冰箱中取出置于冰上。打開水浴鍋，調(diào)成65度。 將RNA樣品濃度大于200ng/μl的用DEPC水稀釋到200ng/μl。. 樣品標(biāo)記：用記號筆在八連管上標(biāo)記好每管反轉(zhuǎn)錄的樣本編號。. 加樣：按以下體系加樣總RNA1002000ngRT引物1μlH2Oup to 11μl以上樣品混合，65℃水浴5 min后，立刻冰上放置。再將每個反應(yīng)管中，加入9μl RTMix,以上樣品輕輕混勻后，短暫離心使液體都集中于管底，. 整理實(shí)驗(yàn)臺：試劑用完后，應(yīng)立即放回冰箱凍存，RNA樣品立刻放回80℃冰箱，防止降解。. 上機(jī)反應(yīng)：把加完樣的PCR 反應(yīng)管按照以下程序進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃5 min42℃60min75℃10min4℃∞. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：對擴(kuò)增產(chǎn)物取5ul加1ul loading buffer進(jìn)行電泳，如電泳條帶清晰，單一且產(chǎn)物條帶與理論值相同，認(rèn)為反轉(zhuǎn)錄成功，可用于realtime PCR，否則重新進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。并將電泳結(jié)果拍照存檔。6. 注意事項(xiàng)：. 反轉(zhuǎn)錄的加樣試劑和加樣量，及反應(yīng)條件要根據(jù)不同的反轉(zhuǎn)錄酶說明書進(jìn)行調(diào)整。. 所有操作均于冰上進(jìn)行。. 均需用RNA free的槍頭及離心管。. 如果cDNA暫時不用于實(shí)驗(yàn)，放入20℃保存。題目：基因mRNA表達(dá)檢測標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程起草： 日期：審核：日期：編號： JSLJSOP0008000批準(zhǔn)：日期：頒發(fā)部門：技術(shù)部生效日期：分發(fā)部門：技術(shù)部基因mRNA表達(dá)檢測標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程1. 目的：檢測組織或血液中某種基因的mRNA表達(dá)水平。2. 適用范圍：本程序適用于對各種生物體的cDNA 樣本進(jìn)行mRNA定量分析檢測。3. 實(shí)驗(yàn)原理：real time PCR，即實(shí)時監(jiān)測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行解析的方法，它是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)，并通過real time PCR檢測系統(tǒng)對PCR反應(yīng)進(jìn)程中的熒光信號強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測，最后對未知模板進(jìn)行定量分析的方法 。4. 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：. 試劑： 2PCR反應(yīng)液Ⅲ、內(nèi)參及目標(biāo)基因引物. 設(shè)備：、96孔板（或8連管），10μl和200μl的槍頭，封板膜（或8連管管蓋），冰盒，RealTime PCR儀（ABI7500）、離心機(jī)等。. 樣本確認(rèn)：根據(jù)樣本登記表的信息對樣本進(jìn)行確認(rèn)，并確認(rèn)RNA的濃度大于100 ng/uL,260/。5. 實(shí)驗(yàn)步驟. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：每個樣品均有一個內(nèi)參基因（GAPDH）?？稍?6孔板的格式紙上填寫實(shí)驗(yàn)的樣品和引物，以便對照加樣。. 加樣：加樣時，先按比例混合PCR反應(yīng)液Ⅲ和H2O，每個孔分裝17ul，再加引物，最后加模板。加完樣后用貼膜將板封好，并用無塵紙輕輕擦拭，使膜固定。（注意：封膜時，手只能觸及膜的邊緣，不能觸及膜的中間部分，防止污染影響膜的透光性。）◆ 反應(yīng)體系為：共20μl體系PCR反應(yīng)液Ⅲ10μl引物1μl cDNA2μlH2O7μl . 上機(jī)：將96孔板放入RealTime PCR儀的托盤上，關(guān)上托盤。打開7500 Software ，按照96孔板格式紙上的內(nèi)容，一一對應(yīng)，設(shè)置每孔的樣品和引物，其中target為引物，sample為樣品?！? 反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃15min　95℃15s40cycle60℃（★）32s95℃15smelt cycle60℃1min（★）95℃15s備注：★表示在此步要采集熒光信號；melt cycle中從60℃到95℃℃采集一次熒光信號?！? 運(yùn)行開始。（注意：等PCR儀的托盤上移，儀器開始運(yùn)行時，才可以離開此時可根據(jù)儀器上顯示的總程序時間初步判斷反應(yīng)程序有沒有設(shè)置錯誤。）. 電泳：運(yùn)行完畢，用排槍在每孔加入3μl loading buffer，并用槍混勻。然后用排槍加樣，跑電泳，180V，10 min。. 結(jié)果判斷：a) 樣品溶解曲線峰型單一，溶解溫度與驗(yàn)證時相近b) 陰性對照沒有起峰；或溶解曲線峰型比較雜亂，CT值超過33.c) 符合上述條件即認(rèn)為樣品檢測成功，否則重做。6. 數(shù)據(jù)處理：取每個基因的平均CT值，采用△Ct法 (CT值比較法)來計(jì)算樣本目的基因的表達(dá)差異。△Ct（待測樣本）2=目的基因Ct值2—參照基因Ct值27. 關(guān)機(jī)及實(shí)驗(yàn)臺清理：實(shí)驗(yàn)完成后，將已用過的96孔板或是8連管從托盤上取下來，并關(guān)閉托盤。按照分析軟件、7500主機(jī)、電腦的順序依次關(guān)機(jī)。再將實(shí)驗(yàn)過程中所用到的試劑和移液器、槍頭等整理歸位，并對實(shí)驗(yàn)操作臺進(jìn)行清理和消毒。8. 注意事項(xiàng)：. 所有操作均在冰上進(jìn)行。. 加樣時，每加完一種試劑均需進(jìn)行離心,避免交叉污染。. 如果實(shí)驗(yàn)在5天內(nèi)做完，將樣品放于4度冰箱，避免反復(fù)凍融。EGFR基因突變 QPCR 標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程題目：EGFR基因突變 QPCR 標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程起草： 日期：審核： 日期：編號： JSLJSOP0009000批準(zhǔn)： 日期：頒發(fā)部門：技術(shù)部生效日期：分發(fā)部門：技術(shù)部：檢測組織或血液中EGFR基因型。：本程序適用于對各種生物體的DNA 樣本進(jìn)行突變檢測。：real time PCR，即實(shí)時監(jiān)測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行解析的方法，它是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)，并通過real time PCR檢測系統(tǒng)對PCR反應(yīng)進(jìn)程中的熒光信號強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測，最后對未知模板進(jìn)行定量分析的方法 。：：2PCR反應(yīng)液Ⅰ、2PCR反應(yīng)液Ⅱ,自制QPCR引物。：、96孔板（或8連管），10ul和200ul的槍頭，封板膜（或8連管管蓋） ， RealTime PCR儀（ABI7500）、離心機(jī)：根據(jù)樣本登記表的信息對樣本進(jìn)行確認(rèn)，并確認(rèn)DNA的濃度大于5ng/uL,260/。 試劑準(zhǔn)備：取出包裝盒中的各組分，室溫放置，待其溫度平衡至室溫后，混勻并短暫離心，確保試劑集中于管底部，備用。 PCR反應(yīng)混合液的配制：、陽性、陰性對照數(shù)量，參照表3和表4所示比例，取相應(yīng)量的PCR反應(yīng)液及相應(yīng)的檢測試劑，配置各PCR反應(yīng)混合液，充分混勻，瞬時離心后備用。表3. Exon121突變檢測PCR反應(yīng)混合液（μl/test） 表4. Exon120突變檢測PCR反應(yīng)混合液（μl/test）組分體積2PCR反應(yīng)液Ⅰ10μl引物探針混合液（E19/E21）1μlddH2O7μl組分體積2PCR反應(yīng)液Ⅱ10μl引物探針混合液（E18/E20）1μlddH2O7μl DNA樣本準(zhǔn)備：將待測DNA樣本分別標(biāo)記為S1，S2 ，S3，S4，S5，S6，S7，S8，S9，S10，陽性質(zhì)控標(biāo)記為CTR，陰性質(zhì)控標(biāo)記為NTC。由于樣本來源不同，DNA質(zhì)量也會不一樣，用于反應(yīng)的DNA濃度不得高于50ng/μl，建議石蠟包埋或病理切片組織來源的DNA濃度為2030ng/μl（即每個反應(yīng)DNA量為4060ng），其它來源的DNA濃度建議為510 ng/μl（即每個反應(yīng)DNA量為1020ng）。 每個反應(yīng)分別取18μl上述PCR反應(yīng)混合液，加入2μl待測DNA樣本、質(zhì)控品或ddH2O，使得總體積為20μl，蓋上96孔板膜，離心將液體甩至管底，轉(zhuǎn)移到擴(kuò)增檢測區(qū)，待用。實(shí)驗(yàn)布局（96孔板），建議如表5：表5. PCR儀（96孔板）建議布局位點(diǎn)123456789101112AE18MS1S2S3S4S5S6S7S8S9S10CTRNTCBE18NS1S2S3S4S5S6S7S8S9S10CTRNTCCE20MS1S2S3S4S5S6S7S8S9S10CTRNTCDE20NS1S2S3S4S5S6S7S8S9S10CTRNTCEE19MS13S14S15S16S17S18S19S20S21S22CTRNTCFE19NS13S14S15S16S17S18S19S20S21S22CTRNTCGE21MS13S14S15S16S17S18S19S20S21S22CTRNTCHE21NS13S14S15S16S17S18S19S20S21S22CTRNTC 核酸擴(kuò)增： 將96孔板放入熒光定量PCR儀上，選擇探針模式，設(shè)置熒光：ABI儀器探針模式熒光設(shè)置為：Reporter Dye：FAM；Quencher Dye：None；Passive Reference：None。 設(shè)置以下反應(yīng)程序： 第一階段：95℃ 10分鐘，1個循環(huán)；第二階段：95℃ 10秒，58℃ 45秒，40個循環(huán)熒光信號收集：在第二階段反應(yīng)的58℃時進(jìn)行FAM熒光信號收集；運(yùn)行實(shí)時PCR反應(yīng)，保存文件。6. 結(jié)果分析（請參照各儀器使用說明書進(jìn)行設(shè)置）確認(rèn)未選擇校正熒光參照，對擴(kuò)增曲線進(jìn)行分析。根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的Start值、End值（用戶可根據(jù)實(shí)際情況自行調(diào)整，Start值可以在3～1End值可設(shè)在5～20），Threshold值（Rn）選擇為擴(kuò)增曲線升起的拐點(diǎn)處（即剛進(jìn)入對數(shù)增長期），點(diǎn)擊Analyze進(jìn)行分析，然后到Plate窗口下記錄每個反應(yīng)的Ct值。：本試劑盒的檢測下限為：。：實(shí)驗(yàn)完成后，將已用過的96孔板或是8連管從托盤上取下來，并關(guān)閉托盤。按照分析軟件、7500主機(jī)、電腦的順序依次關(guān)機(jī)。再將實(shí)驗(yàn)過程中所用到 ：，每加完一種試劑均需進(jìn)行離心,避免交叉污染。，注意換槍頭，避免交叉污染。，才可以離開。KRAS基因突變 QPCR 標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程題目：KRAS基因突變 QPCR 標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程起草： 日期：審核： 日期：編號： JSLJSOP0010000批準(zhǔn)： 日期：頒發(fā)部門：技術(shù)部生效日期：分發(fā)部門：技術(shù)部：檢測組織或血液中KRAS基因型。：本程序適用于對各種生物體的DNA 樣本進(jìn)行突變檢測。：real time PCR，即實(shí)時監(jiān)測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行解析的方法，它是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)，并通過real time PCR檢測系統(tǒng)對PCR反應(yīng)進(jìn)程中的熒光信號強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測，最后對未知模板進(jìn)行定量分析的方法 。：：2PCR反應(yīng)液Ⅰ,自制QPCR引物。：、96孔板（或8連管），10ul和200ul的槍頭，封板膜（或8連管管蓋） ， RealTime PCR儀（ABI7500）、離心機(jī)：根據(jù)樣本登記表的信息對樣本進(jìn)行確認(rèn)，并確認(rèn)DNA的濃度大于5ng/uL,260/。 試劑準(zhǔn)備：取出包裝盒中的各組分，室溫放置，待其溫度平衡至室溫后，混勻并短暫離心，確保試劑集中于管底部，備用。 PCR反應(yīng)混合液的配制：、陽性、陰性對照數(shù)量，參照表3比例取相應(yīng)量的PCR反應(yīng)液及相應(yīng)的檢測試劑，配置PCR反應(yīng)混合液，充分混勻，瞬時離心后備用。表3. 各PCR反應(yīng)混合液組份比例（μl/test）組分體積2PCR反應(yīng)液Ⅰ10μl引