生物化學(xué)講義第六章核酸-資料下載頁
2025-06-07 21:29本頁面
【正文】 稱（反向重復(fù)）。II型酶的切割頻率識別位點(diǎn) 4 44=256 6 46=4096 8 48=65536Not I GCGGCCGC限制酶的命名：第一位： 屬名E（大寫）第二、三位： 種名的頭兩個字母小寫co第四位： 菌株R第五位： 羅馬字，從該細(xì)菌中分離出來的這一類酶的編號。同裂酶：來源不同的限制酶（名稱自然不同），識別同樣的核苷酸靶序列，產(chǎn)生同樣的切割，形成同樣的末端。BamH： GGATCC 同裂酶 BstI識別位點(diǎn)相同，切割位點(diǎn)相同，產(chǎn)生同樣的粘性末端。同尾酶：來源各異，識別的靶序列不同，但都產(chǎn)生相同的粘性末端。BamHI：GGATCC同裂酶：BstI GGATCC同尾酶：BclI TGATCA BglII AGATCT MboI GATC Sau3A GATC星號活力：在一定條件下（低離子強(qiáng)度，堿性pH，或50%甘油），限制酶的特異性降低。結(jié)果，它的識別與切割所需的典型的核苷酸序列的數(shù)量和種類會發(fā)生變化。例如 HindIII AAGCTT四、 DNA物理圖譜及構(gòu)建（限制酶切圖譜、DNA酶切位點(diǎn)圖譜）在研究某一種DNA時，弄清該DNA分子有哪些限制酶切位點(diǎn)是很重要的。建立物理圖譜是進(jìn)一步分析此DNA的基礎(chǔ)，末端標(biāo)記法構(gòu)建DNA物理圖譜：（1）單酶完全降解和部分降解（2）雙酶降解 圖五、 分子雜交 Southern BlottingP353 圖523DNA樣品 酶切 電泳 變性 轉(zhuǎn)膜 固定 雜交 洗滌 放射自顯影變性（NaOH ）轉(zhuǎn)膜（NC膜）固定（80℃，46h）雜交（高鹽濃度，68℃，幾小時）Southern Blotting可用于DNA之間同源性分析，確定特異性DNA序列的大小和定位。可用DNA或RNA探針。 Northern Blotting研究對象是mRNA檢測可與探針DNA同源雜交的mRNA分子的存在，因而可以研究細(xì)胞內(nèi)特定mRNA的產(chǎn)生，即特定基因的表達(dá)。mRNA易形成局部二級結(jié)構(gòu)，因此，總RNA或mRNA需在變性條件下電泳，乙二醛、甲醛可防止RNA形成二級結(jié)構(gòu)。 Western Blotting是研究克隆基因表達(dá)產(chǎn)物、鑒定克隆株的常用技術(shù)。六、 DNA序列分析（一） 化學(xué)裂解法（MaxamGilbert 法）DNA一級結(jié)構(gòu)測定原理：利用特異性的化學(xué)裂解法，制備出具有同一標(biāo)記末端，而另一端是長度只差一個核苷酸的片段群，然后將此片段群在能夠分辨長度只差一個核苷酸DNA片段的PAGE上分離。一定濃度的特測片段 32PGCTACGTA特異性化學(xué)裂解在A處：32PGCT和32PGCTACGT在G處：32pGCTA在C處：32PG和 32PGCTA在T處：32PGC和32PGCTACG 圖硫酸二甲酯特異切割：G甲酸特異切割：G和A肼在Nacl條件下切割：C肼在無Nacl條件下切割：T和C32P *ACTTCGACAA硫酸二甲酯： *ACTTC甲酸： *P *ACTTC*ACTTCG *ACTTCGAC *ACTTCGACA肼（有Nacl）： *A *ACTT *ACTTCGA肼（無Nacl）： *A *AC *ACT *ACTT*ACTTCGA從下往上讀：CTACGTA末端G不能讀出。（二） 雙脫氧終止法英國 Sanger 1955 確定牛胰島素結(jié)構(gòu) 1958 獲諾貝爾化學(xué)獎 1980 設(shè)計出DNA測序法 1980 再獲諾貝爾化學(xué)獎合成一段與待測DNA序列互補(bǔ)的DNA片段群。 圖胰島素的基因工程： 63個核苷酸 90個核苷酸（三） 序列分析儀四色熒光基團(tuán)標(biāo)記的ddNTP七、 DNA合成（合成探針、引物、基因） 化學(xué)合成——DNA合成儀DNA固相合成（亞磷酸三酯法）合成方向：3’ 5’端5’OH用二對甲氧三苯甲基（DMT）保護(hù)，堿基上氨基用苯甲酸保護(hù)3’OH用氨基磷酸化合物活化P353 合成過程 保護(hù)： 5’OH、活化3’OH、保護(hù)所有NH2 DNA的酶合成——PCR用DNA聚合酶I必備條件：①模板DNA（單鏈）②引物③DNA聚合酶④dATP、 dGTP、dCTP、dTTP ⑤一定濃度的Mg2+鏈合成方向：5 ’ 3’端新的DNA鏈合成，從引物DNA的3’OH開始。 圖鏈的增長反應(yīng)是引物DNA的3’OH，對脫氧核糖核苷三磷酸的α磷原子親核進(jìn)攻的結(jié)果?；瘜W(xué)合成：方向3’ 5’，不需DNA模板，不用酶。生物合成：方向5’ 3’，需模板，引物，用酶。 計劃：6
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