微生物法生產(chǎn)煙酰胺發(fā)酵工藝的研究-資料下載頁
2025-06-07 00:09本頁面
【正文】 acillus pallidus Dae52 ++ 30℃ Rhochococcus + 35℃ Pseudomones chlororaphis B23 25℃ Bacillius DSM2349 ++ 65℃ Norcardia 28℃ 較不耐熱 不耐熱 +耐熱 ++較耐熱溫度對于酶活的影響至關(guān)重要。酶本質(zhì)上是一種蛋白質(zhì),超過其最適宜的溫度范圍,酶蛋白的三維結(jié)構(gòu)容易受熱發(fā)生變化,進(jìn)而使酶活降低或者使酶失活。對于本文中的腈水合酶來說,其容易受熱不穩(wěn)定,即熱不穩(wěn)定性。如表 14列舉了多種腈水合酶酶活與溫度的關(guān)系。 在一定的范圍之內(nèi),隨溫度的升高,酶活隨之上升,且水合反應(yīng)為放熱反應(yīng),所以10 1 前 言 菌株的耐熱性是十分重要的。低溫對于酶活的保持是十分有利的,耐熱性菌在工業(yè)應(yīng)用上是非常有優(yōu)勢的。 課題研究意義 煙酰胺作為一種重要的酰胺類化合物之一,是人和動物發(fā)育不可缺少的養(yǎng)分。煙酰胺在食品,醫(yī)藥,飼料等領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛。隨著全球人民生活水平的提高,食品的結(jié)構(gòu)從植物型開始向動物型方面轉(zhuǎn)變,因此飼料工業(yè)發(fā)展迅速,對煙酰胺的需求越來越大,大批量地生產(chǎn)煙酰胺,對其現(xiàn)存的市場以及潛在的市場來說都具有重大的意義。微生物法生產(chǎn)煙酰胺,該工藝具有以下優(yōu)點:反應(yīng)條件溫和,轉(zhuǎn)化率高,選擇性高,產(chǎn)品質(zhì)量高而且無污染等。致力于該工藝過程中高產(chǎn)腈水合酶菌株的篩選,以及發(fā)酵條件的優(yōu)化工作,對于提高工業(yè)生產(chǎn)中煙酰胺的產(chǎn)量具有極大促進(jìn)作用。 課題研究內(nèi)容 目前本實驗室已擁有出發(fā)菌株以及培養(yǎng)所需的相應(yīng)的設(shè)備及檢測所需要的儀器、藥品及方法,并參考相關(guān)的文獻(xiàn),可獨立開展實驗且摸索出適合自己實驗室特有的微生物法生產(chǎn)煙酰胺的工藝。該工藝的核心是如何提高腈水合酶的活性,圍繞著這個核心,本課題主要開展了以下幾方面的工作: 高酶活菌株的 篩選 以諾卡氏菌 Norcardia 。通過考察紫外線,微波及硫酸二乙酯對其發(fā)酵產(chǎn)酶的影響,確定了各誘變劑的最佳誘變處理條件。在此基礎(chǔ)上設(shè)計多組復(fù)合誘變試驗,以快速高效地篩選出高酶活的突變株。 發(fā)酵條件的優(yōu) 化 在煙酰胺搖瓶發(fā)酵的工藝基礎(chǔ)上,通過發(fā)酵培養(yǎng)條件單因素優(yōu)化實驗,研究種齡、接種量、裝液量、培養(yǎng)基初始 pH值、發(fā)酵培養(yǎng)溫度和?床轉(zhuǎn)速對腈水合酶酶活的影響。并選取發(fā)酵條件中的四個因素設(shè)計正交試驗,進(jìn)一步確定其產(chǎn)酶的最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件。 發(fā)酵培養(yǎng)基的 優(yōu)化 通過單因素實驗來篩選發(fā)酵培養(yǎng)基中的較為適合的碳源、氮源,脲,鈷離子等因素,以及它們的最適用量,通過采用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基,最終確定最適發(fā)酵培11 微生物法生產(chǎn)煙酰胺發(fā)酵工藝的研究 養(yǎng)基。12 2 材料與方法 2 材 料與 方法 材料 菌種 諾卡氏菌 Norcardia ,河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物工程實驗室保藏。 培養(yǎng)基 活化培養(yǎng)基g/L:葡萄糖 10, 酵母膏 5 ,NaCl 1, K HPO 2,瓊脂 20,pH ,2 4 115 ℃滅菌 15 min。篩選培養(yǎng)基g/L: 3氰基吡啶 8,葡萄糖 15,酵母膏 3, NaCl 1, MgSO , K HPO4 2 4 ,瓊脂 15,pH ,115 ℃滅菌 15 min。 種子培養(yǎng)基g/L:葡萄糖 15,酵母膏 6,尿素 6,KH PO ,K HPO ,2 4 2 4MgSO 7H O ,谷氨酸鈉 1,pH ,115 ℃滅菌 15 min。 4 2發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基g/L:葡萄糖 20,酵母膏 5,KH PO ,K HPO ,谷氨酸鈉2 4 2 41,脲 7,MgSO 7H O ,鈷離子 10 mg,pH ,115 ℃滅菌 15 min。 4 2 主要試劑 13 微生物法生產(chǎn)煙酰胺發(fā)酵工藝的研究 表 21 主要試劑一覽表 The table of main reagents 試劑名稱 型號 生產(chǎn)廠家 氯化鈷 分析純 天津市德恩化學(xué)試劑有限公司 鹽酸 分析純 開封東大化工試劑廠 3氰基吡啶 化學(xué)級 派尼化學(xué)試劑廠 葡萄糖 分析純 天津市科密歐化學(xué)試劑公司 酵母膏 生化級 北京市奧博星生物技術(shù)公司 脲 分析純 天津化學(xué)試劑一廠 硫酸鎂 分析純 天津市科密歐化學(xué)試劑公司 磷酸二氫鉀 分析純 天津市科密歐化學(xué)試劑公司磷酸氫二鉀 生化級 上?？到萆锟萍加邢薰?谷氨酸鈉 分析純 天津市化學(xué)試劑六廠 氯化鈉 食用級 福建莆田聯(lián)邦瓊脂公司 瓊脂 分析純 天津市科密歐化學(xué)試劑公司 氫氧化鈉 分析純 天津市化學(xué)試劑六廠亞硫酸鈉 生化級 天津市科密歐化學(xué)試劑中心 酒石酸鉀鈉 分析純 天津市德恩化學(xué)試劑有限公司 苯酚 生化級 天津市德恩化學(xué)試劑有限公司 硫酸二乙酯 分析純 天津市科密歐化學(xué)試劑公司 主要儀器14 2 材料與方法 表 22 主要儀器一覽表 The table of main equipments 儀器名稱 型號 生產(chǎn)廠家 Agilent1100 高效液相色譜儀 德國 Bruker公司 KJ23BDE 美的微波爐 廣東美的微波爐制造有限公司 ZHWY111 2B 恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海智誠分析儀器有限公司 DV04123 移液器 大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司 SWCJ2FD 超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司 HH88 水浴鍋 國華電器有限公司 UV1750 紫外可見分光光度計 島津儀器(蘇州)有限公司 SX500 高壓蒸汽滅菌鍋 日本 TOMY TGL16 臺式高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器公司 DM2000 生物顯微鏡 德國徠卡 實驗方法 培養(yǎng)方法 斜面培養(yǎng):將本實驗保存的諾卡氏菌挑取一環(huán)轉(zhuǎn)接于斜面活化培養(yǎng)基,置于 28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4 d。 搖瓶種子培養(yǎng):取一環(huán)活化的諾卡氏菌接入種子培養(yǎng)基(裝液量為 25 mL/250 mL ),置于 28 ℃,200 rpm 的搖床培養(yǎng) 36 h。 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng):將種子培養(yǎng)液按 8 %的接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵瓶裝液量為 25 mL/250 mL,置于 28 ℃、200 rpm 的搖床培養(yǎng) 48 h。 分析方法 1 菌體生長曲線的測定:每 8個小時取 1 mL的培養(yǎng)液稀釋 10倍,在 600 nm 下用紫外分光光度計測其 OD值,以沒有接菌的發(fā)酵液作為空白對照。以時間為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),確定生長曲線。 2 菌體干重的測定:每 8個小時取培養(yǎng)液 20 mL,6000 rpm 離心 20 min,用 PBS磷酸緩沖液pH 3次,105 ℃干燥至恒重后稱重,確定其生長曲線。 3 發(fā)酵過程中 pH 曲線的測定:從接上種子液開始,每 8個小時取一次樣,用 pH15 微生物法生產(chǎn)煙酰胺發(fā)酵工藝的研究 計測定 pH值,確定其 pH 曲線。 4 發(fā)酵過程中殘?zhí)乔€的測定: a DNS 法測定培養(yǎng)液中的還原糖:DNS 法即通常所說的二硝基水楊酸法,這種方法是在堿性條件下,二硝基水楊酸(DNS)與培養(yǎng)液中的還原糖發(fā)生氧化還原反應(yīng),從而生成 3氨基5硝基水楊酸,該產(chǎn)物在煮沸條件下發(fā)生顏色反應(yīng),即顯棕紅色,并且在一定濃度范圍內(nèi)該顏色的深淺與培養(yǎng)液中還原糖含量成比例關(guān)系,利用比色法即可測定還原糖含量。 b DNS 試劑的制備:配置 500 mL,182 g酒石酸鉀鈉溶液,加熱,然后分別加入 g二硝基水楊酸和 262 mL 2 mol/L氫氧化鈉,攪拌均勻,將 5 g重苯酚和 5 g亞硫酸鈉加入溶液中,攪拌溶解,冷卻后裝入容量瓶,加水定容到 1000 mL,即可制成 3,5二硝基水楊酸試劑,將試劑貯于棕色瓶中備用。 c 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:配置 1 mg/ mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液,將 0、、 mL的標(biāo)準(zhǔn)液分別倒入 6支 25 mL試管中,然后每支試管加入
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