卵母細(xì)胞成熟ppt課件-資料下載頁
2025-05-06 18:00本頁面
【正文】 ， 5min/次 ↓ %Triton X100(v/v)滲透細(xì)胞膜， RT， 30min ↓ DPBS＋ 2%BSA封閉， RT， 1h ↓ 一抗 (1:100)孵育， RT, 1h ↓ DPBS＋ %PVP，洗滌 3次， 10min/次 ↓ 進(jìn)口二抗 (1:100)孵育， ℃ , 1h，避光 ↓ DPBS＋ %PVP，洗滌 3次， 10min/次，避光 ↓ Hoechst33342(10μg/ml)孵育， RT， 10min，避光 ↓ DPBS＋ %PVP，洗滌 3次， 5min/次，避光 ↓ 封片，拍照， DNA核在 UV光下激發(fā)而組蛋白乙酰化熒光信號(hào)在 Blue下激發(fā) 熒光免疫染色和 DAPI染色實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)原理 免疫染色的實(shí)驗(yàn)原理類似于 Western Blotting，兩者都是運(yùn)用抗體的特異性識(shí)別作用來顯示目的蛋白，但是由于免疫染色需要在原位進(jìn)行，而且蛋白沒有經(jīng)過富集，因此其實(shí)驗(yàn)難度較高。 實(shí)驗(yàn)的基本原理是：利用固定劑（通常是甲醛或多聚甲醛）將細(xì)胞固定，使得細(xì) 胞膜的通透性大大增加，并且利用 TritonX100使得一部分膜蛋白變性，從而使通透性進(jìn)一步加強(qiáng)。利用正常羊血清封閉，可以令許多蛋白先與血清內(nèi)的非特異性抗體結(jié)合，而特異性的抗體由于動(dòng)力學(xué)的關(guān)系可以通過競爭性的反應(yīng)與目的蛋白結(jié)合，這一過程可以保證抗體識(shí)別的特異性。二抗可以特異性識(shí)別一抗的 Fc區(qū)域，利用二抗連接不同的熒光基團(tuán)，就可以在熒光顯微鏡下觀察到不同的熒光，從而顯示目的基因的表達(dá)情況。另外，免疫熒光實(shí)驗(yàn)由于其較高的敏感性可以顯示出基因表達(dá)的亞細(xì)胞情況 (核內(nèi)，核外，膜上以及一些較大的細(xì)胞器上 )，所以通常被用來作為基因定位的方法。 DAPI的中文名稱是 4， 6聯(lián)脒 2苯基吲哚，是一種常用的熒光染料，其作用機(jī)理與溴化乙錠（ EB）等染色劑的機(jī)理類似：它們與 DNA雙螺旋的凹槽部分可以發(fā)生相互作用，從而與 DNA的雙鏈緊密結(jié)合。結(jié)合后產(chǎn)生的熒光基團(tuán)的吸收峰是 358nm而散射峰是 461nm，正好 UV（紫外光）的激發(fā)波長是 356nm，使得 DAPI成為了一種常用的熒光檢測信號(hào)。 Jagielski M. et. Al在 1976年首次運(yùn)用該技術(shù)檢測細(xì)胞培養(yǎng)中的支原體感染。后來隨著技術(shù)的進(jìn)步，該技術(shù)被運(yùn)用于各種微生物的檢測、生長監(jiān)測，胚胎發(fā)育過程的檢測，細(xì)胞周期的檢測和各種核定位的實(shí)驗(yàn)。 Triton X100 ? Triton X100(聚乙二醇辛基苯基醚 ) 是一種非離子型表面活性劑（或稱去污劑）。分子量為 （ C34H62O11）。它能溶解脂質(zhì)，以增加抗體對細(xì)胞膜的通透性。免疫細(xì)胞化學(xué)中 Triton X100常用濃度為 1%和 %，其中 1%的 Triton X100常用于漂洗組織標(biāo)本，%的 Triton X100則常用于稀釋血清，%的 Triton X100常用于 LAMP（環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增），配制 BSA等。但通常是先配制成30%的 Triton X100儲(chǔ)備液，臨用時(shí)稀釋至所需濃度。 PVP聚乙烯吡咯烷酮 ? PVP具有抗污垢再沉淀性能，可用于配制透明液體或重污垢洗滌劑，在洗滌劑中添加PVP有很好的防轉(zhuǎn)色效果，而且可以增強(qiáng)凈洗能力，洗滌織物時(shí)可防止合成洗滌劑對皮膚的刺激，尤其對合成纖維，此性能比羧甲基纖維素 (CMC)類洗滌劑更為突出。PVP可與硼砂復(fù)配，作為含酚消毒清潔劑配方中的有效成分。 PVP與過氧化氫固體復(fù)配的洗滌劑中，具有漂白、殺滅病菌的作用。
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