【正文】 c v o l t a g e si o n s w i t hc o r r e s p o n d i n gm / z i o n s c o l l i d ew i t h t h e r o d sDetector鑒定和注釋蛋白質(zhì)的路線 ? 通過(guò)肽質(zhì)譜指紋圖（ peptide mass fingerprinting， PMF）和數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋匹配 ? 通過(guò)測(cè)出樣品中部分肽段二級(jí)質(zhì)譜信息或氨基酸序列標(biāo)簽和數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋匹配 質(zhì)譜技術(shù)在蛋白組學(xué)研究中的應(yīng)用 蛋白質(zhì)的序列分析 通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜（ tandemMS）實(shí)現(xiàn) 研究蛋白質(zhì)修飾 磷酸化 糖基化 N端封閉 （七） 蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)分析 ? 溶液中蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)分析方法 磁共振 （ nuclear magic resonance,NMR）、圓二色譜法、激光拉曼光譜法、熒光光譜法、紫外差光譜法、氫放射性核素交換法 ? 晶體蛋白分子結(jié)構(gòu)分析 X射線衍射分析法、小角中子衍射法 （八）蛋白質(zhì)芯片技術(shù) ? 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是一種高通量、平行、自動(dòng)化、微型化的蛋白質(zhì)表達(dá)、結(jié)構(gòu)和功能分析技術(shù)。分為生物化學(xué)芯片、化學(xué)性芯片、生物反應(yīng)器芯片三類。 蛋白質(zhì)芯片 第三節(jié) 蛋白質(zhì)相互作用研究 一、蛋白質(zhì)相互作用研究方法 ? 酵母雙雜交系統(tǒng) （ yeast twohybrid system） ? 噬菌體表面顯示技術(shù) （ phage display） ? 基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)相互作用研究方法 親和層析 +多維液相色譜耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù) （ MDLCESIMS/MS） 免疫共沉淀耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)； 生物傳感器耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)； 串聯(lián)親和純化耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù) 酵母雙雜交系統(tǒng) DNABD具有與報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)特異結(jié)合的功能， DNAAD則具有活化轉(zhuǎn)錄的功能。 報(bào)告基因 ? DNABD和 DNAAD分開(kāi)時(shí)不能激活轉(zhuǎn)錄，只有當(dāng)兩者在空間上接近時(shí)，才能呈現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子的活性。 ? 只有當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì) X與蛋白質(zhì) Y間發(fā)生相互作用時(shí)，才能激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄，而當(dāng)兩者單獨(dú)作用時(shí)均無(wú)此功能 。 二、蛋白質(zhì) 核酸相互作用 研究方法 ? 凝膠滯后實(shí)驗(yàn) ? 濾膜結(jié)合法 ? 甲基化干擾試驗(yàn) ? DNaseⅠ 足紋分析 ? 核酸 蛋白質(zhì)雜交實(shí)驗(yàn) 凝膠滯后試驗(yàn) ? 蛋白質(zhì)可以與末端標(biāo)記的核酸探針特異性結(jié)合，所形成的復(fù)合物電泳時(shí)在凝膠中的泳動(dòng)速度比未與蛋白結(jié)合的游離探針慢，即表現(xiàn)為相對(duì)滯后 ? 該實(shí)驗(yàn)可以評(píng)價(jià)蛋白與核酸結(jié)合的特異性 濾膜結(jié)合法 利用硝酸纖維素濾膜不能結(jié)合雙鏈 DNA，但可與蛋白質(zhì)結(jié)合的特性，將與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA片段與游離 DNA片段分離開(kāi)。 甲基化干擾 將 DNA 甲基化后與蛋白質(zhì)進(jìn)行反應(yīng)，只有在結(jié)合位點(diǎn)上未被修飾的 DNA 片段才能與蛋白質(zhì)結(jié)合。 用特殊方法將 DNA從被修飾的堿基處進(jìn)行切割，并經(jīng)電泳分離。 未結(jié)合蛋白質(zhì)的 DNA可在隨機(jī)修飾的位點(diǎn)被切割，而結(jié)合蛋白質(zhì)的DNA在結(jié)合位點(diǎn)上未被修飾而不能被切割，由此可獲得蛋白質(zhì)與核酸定位結(jié)合的信息。 DNA探針的末端標(biāo)記 及探針的甲基化 蛋白質(zhì)與甲基化探針的結(jié)合及 DNA－蛋白質(zhì)結(jié)合探針的分離 結(jié)合物及對(duì)照探針 的化學(xué)切割 DNA片段的序列測(cè)定 DNaseⅠ 足紋 目前廣泛用于蛋白質(zhì)精確結(jié)合位點(diǎn)的研究方法 原理： DNaseⅠ 可以隨機(jī)水解核苷酸中的磷酸二酯鍵，將 DNA切成單核苷酸，而結(jié)合有蛋白質(zhì)的 DNA免于 DNaseⅠ 的水解。 DNaseⅠ 足紋分析原理示意圖 核酸 蛋白質(zhì)雜交實(shí)驗(yàn) TBE緩沖液中 DNA蛋白質(zhì)雜交 放射自顯影 用于鑒定蛋白質(zhì)與 DNA的特異性結(jié)合和確定結(jié)合蛋白質(zhì)的分子量。 基本步驟： 蛋白質(zhì)雜交 SDSPAGE 轉(zhuǎn)移至 NC膜或 Nylon膜 緩慢復(fù)性、封閉、預(yù)雜交 加入同位素標(biāo)記的 DNA片段作探針 多次洗膜 第四節(jié) 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)及其應(yīng)用 一、蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù) (proteome database) ? 蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)被認(rèn)為是蛋白質(zhì)組知識(shí)的儲(chǔ)存庫(kù)，包含所有鑒定的蛋白質(zhì)信息，如蛋白質(zhì)的順序、核苷酸順序、 2D PAGE、 3D結(jié)構(gòu)、翻譯后的修飾、基因組及代謝數(shù)據(jù)庫(kù)等 （一）蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù) ? SWISSPROT SWISSPROT的網(wǎng)址是 ： ? PIR和 PSD PIR和 PSD的網(wǎng)址是 ： 數(shù)據(jù)庫(kù)下載地址是 ： SWISSPROT ? 是經(jīng)過(guò)注釋的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)，由歐洲生物信息學(xué)研究所 (EBI)維護(hù)。數(shù)據(jù)庫(kù)由蛋白質(zhì)序列條目構(gòu)成，每個(gè)條目包含蛋白質(zhì)序列、引用文獻(xiàn)信息、分類學(xué)信息、注釋等，注釋中包括蛋白質(zhì)的功能、轉(zhuǎn)錄后修飾、特殊位點(diǎn)和區(qū)域、二級(jí)結(jié)構(gòu)、四級(jí)結(jié)構(gòu)、與其它序列的相似性、序列殘缺與疾病的關(guān)系、序列變異體和沖突等信息。 ? 利用序列提取系統(tǒng) (SRS)可以方便地檢索SWISSPROT和其它 EBI的數(shù)據(jù)庫(kù)。 ? SWISSPROT只接受直接測(cè)序獲得的蛋白質(zhì)序列，序列提交可以在其 Web頁(yè)面上完成。 PIR和 PSD ? 國(guó)際蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù) (PSD)是由蛋白質(zhì)信息資源 (PIR)、 慕尼黑蛋白質(zhì)序列信息中心 (MIPS)和日本國(guó)際蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)(JIPID)共同維護(hù)的國(guó)際上最大的公共蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)。這是一個(gè)全面的、經(jīng)過(guò)注釋的、非冗余的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)，包含超過(guò)142,000條蛋白質(zhì)序列 (至 99年 9月 )，其中包括來(lái)自幾十個(gè)完整基因組的蛋白質(zhì)序列。所有序列數(shù)據(jù)都經(jīng)過(guò)整理，超過(guò) 99%的序列已按蛋白質(zhì)家族分類，一半以上還按蛋白質(zhì)超家族進(jìn)行了分類。 PSD的注釋中還包括對(duì)許多序列、結(jié)構(gòu)、基因組和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)的交叉索引，以及數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)部條目之間的索引，這些內(nèi)部索引幫助用戶在包括復(fù)合物、酶－底物相互作用、活化和調(diào)控級(jí)聯(lián)和具有共同特征的條目之間方便的檢索。每季度都發(fā)行一次完整的數(shù)據(jù)庫(kù)，每周可以得到更新部分。 ? PSD數(shù)據(jù)庫(kù)有幾個(gè)輔助數(shù)據(jù)庫(kù)，如基于超家族的非冗余庫(kù)等。 PIR提供三類序列搜索服務(wù)：基于文本的交互式檢索；標(biāo)準(zhǔn)的序列相似性搜索，包括 BLAST、 FASTA等；結(jié)合序列相似性、注釋信息和蛋白質(zhì)家族信息的高級(jí)搜索，包括按注釋分類的相似性搜索、結(jié)構(gòu)域搜索GeneFIND等。 （二）蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù) ? PDB RCSB的 PDB數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)址是 ： ? SCOP SCOP的網(wǎng)址是 ： 。 ? PROSITE PROSITE的網(wǎng)址是 ： SCOP ? 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分類 (SCOP)數(shù)據(jù)庫(kù)詳細(xì)描述了已知的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系。分類基于若干層次：家族，描述相近的進(jìn)化關(guān)系；超家族，描述遠(yuǎn)源的進(jìn)化關(guān)系；折疊子 (fold)，描述空間幾何結(jié)構(gòu)的關(guān)系；折疊類，所有折疊子被歸于全 α、全 β、α/β、 α＋ β和多結(jié)構(gòu)域等幾個(gè)大類。 SCOP還提供一個(gè)非冗余的 ASTRAIL序列庫(kù)，這個(gè)庫(kù)通常被用來(lái)評(píng)估各種序列比對(duì)算法。此外， SCOP還提供一個(gè) PDBISL中介序列庫(kù)，通過(guò)與這個(gè)庫(kù)中序列的兩兩比對(duì)，可以找到與未知結(jié)構(gòu)序列遠(yuǎn)緣的已知結(jié)構(gòu)序列。 PDB ? 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)倉(cāng)庫(kù) (PDB)是國(guó)際上唯一的生物大分子結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)檔案庫(kù)，由美國(guó) Brookhaven國(guó)家實(shí)驗(yàn)室建立。 PDB收集的數(shù)據(jù)來(lái)源于 X光晶體衍射和核磁共振 (NMR)的數(shù)據(jù)，經(jīng)過(guò)整理和確認(rèn)后存檔而成。目前 PDB數(shù)據(jù)庫(kù)的維護(hù)由結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)研究合作組織 (RCSB)負(fù)責(zé)。 RCSB的主服務(wù)器和世界各地的鏡像服務(wù)器提供數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索和下載服務(wù)，以及關(guān)于 PDB數(shù)據(jù)文件格式和其它文檔的說(shuō)明， PDB數(shù)據(jù)還可以從發(fā)行的光盤獲得。使用 Rasmol等軟件可以在計(jì)算機(jī)上按 PDB文件顯示生物大分子的三維結(jié)構(gòu)。 PROSITE ? PROSITE數(shù)據(jù)庫(kù)收集了生物學(xué)有顯著意義的蛋白質(zhì)位點(diǎn)和序列模式，并能根據(jù)這些位點(diǎn)和模式快速和可靠地鑒別一個(gè)未知功能的蛋白質(zhì)序列應(yīng)該屬于哪一個(gè)蛋白質(zhì)家族。有的情況下，某個(gè)蛋白質(zhì)與已知功能蛋白質(zhì)的整體序列相似性很低，但由于功能的需要保留了與功能密切相關(guān)的序列模式，這樣就可能通過(guò) PROSITE的搜索找到隱含的功能 motif，因此是序列分析的有效工具。 PROSITE中涉及的序列模式包括酶的催化位點(diǎn)、配體結(jié)合位點(diǎn)、與金屬離子結(jié)合的殘基、二硫鍵的半胱氨酸、與小分子或其它蛋白質(zhì)結(jié)合的區(qū)域等；除了序列模式之外， PROSITE還包括由多序列比對(duì)構(gòu)建的 profile，能更敏感地發(fā)現(xiàn)序列與profile的相似性。 PROSITE的主頁(yè)上提供各種相關(guān)檢索服務(wù)。 （三）蛋白質(zhì)直系同源簇?cái)?shù)據(jù)庫(kù) ? 蛋白質(zhì)直系同源簇 (COGs)數(shù)據(jù)庫(kù)是對(duì)細(xì)菌、藻類和真核生物的 21個(gè)完整基因組的編碼蛋白，根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分類構(gòu)建而成。 COG庫(kù)對(duì)于預(yù)測(cè)單個(gè)蛋白質(zhì)的功能和整個(gè)新基因組中蛋白質(zhì)的功能都很有用。利用 COGNITOR程序，可以把某個(gè)蛋白質(zhì)與所有 COGs中的蛋白質(zhì)進(jìn)行比對(duì)，并把它歸入適當(dāng)?shù)?COG簇。 COG庫(kù)提供了對(duì) COG分類數(shù)據(jù)的檢索和查詢，基于 Web的 COGNITOR服務(wù)，系統(tǒng)進(jìn)化模式的查詢服務(wù)等。 ? COG庫(kù)的網(wǎng)址是： ? 下載 COG庫(kù)和 COGNITOR程序在： （四） DIP數(shù)據(jù)庫(kù) ? DIP數(shù)據(jù)庫(kù)主要提供蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)之間相互作分析蛋白質(zhì)相互作用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)等方面的信息。 ? 數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)址： 二、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的應(yīng)用 ? 序列比較 ? 臨床診斷 ? 腫瘤治療藥物的開(kāi)發(fā)