【正文】 了得到一張好圖，則無需考慮太多其它因素。 ? 待研究蛋白的豐度 ? 樣品的復(fù)雜度：復(fù)雜度較高的樣品，為了盡可能了解包含的蛋白，需要反復(fù)實驗才能完成。如果待測樣品富集以后則更易分析 ? IPG膠條的 pH范圍： pH范圍越窄，上樣量越大 IPG膠條的上樣量 IPG Strip length Analytical Load (silver staining) Preparative Load (Coom staining) 7cm 10~100 ? g /125 ? l 200~500ug/125 ? l 11cm 50~200 ? g /185 ? l 250~1000ug/185 ? l 17cm 100~300 ? g/300 ? l 1~3mg/300 ? l IPG IEF 中 pH梯度的選擇 ? 常用方法：先寬后窄，先線性后非線性，先短后長，預(yù)試驗確定。 預(yù)分步收集 細胞漿 細胞核 細胞膜 核糖體及其他特定細胞成份 細胞分泌成份 pH412 pH310 pH47 pH58 pH710 pH611 pH36 pH34 pH45 pH56 pH67 pH78 pH89 pH910 pH1011 pH1112 第一步 第二步 第三步 用窄 pH范圍陣列分離低豐度或交叉覆蓋蛋白 陣列那些亞細胞定位位置的功能蛋白質(zhì) 亞蛋白質(zhì)組陣列策略的框架圖 3倍 3倍 聚焦時間的優(yōu)化 ? 理論上講，獲得最好的圖譜質(zhì)量和重復(fù)性所需的最佳時間是 IEF分離達到穩(wěn)定態(tài)所需的時間。 ? 聚焦時間太短，會導(dǎo)致水平和垂直條紋的出現(xiàn)。 ? 過度聚焦雖然不會導(dǎo)致蛋白質(zhì)向陰極漂移，但會因為活性水轉(zhuǎn)運而導(dǎo)致過多水在 IPG膠表面滲出（電滲）而造成蛋白圖譜變性，在膠條堿性端產(chǎn)生水平條紋以及蛋白丟失。 ? 最佳時間的確定需要根據(jù)不同蛋白樣品、上樣量、pH范圍和膠條長度通過經(jīng)驗來確定。 等電聚焦過程 ? 等電聚焦的電壓上升分為三個階段：首先加上一個比較低的電壓，去除膠條中的過多的鹽離子。然后開始加高壓，電壓上升的模式為緩慢上升。最后是持續(xù)高壓，電壓上升的模式為快速上升。 ? 第一向等電聚焦儀 Protean IEF（ BioRad ）最多可加到 10000V的高壓 ? IPGphor（ GE Healthcare）的最高電壓為 8000V ? 一般原則是，根據(jù)膠條的 pH范圍和上樣量的多少，總電壓時間積可以在一定范圍內(nèi)調(diào)整。 ? 上樣量大、 pH范圍窄則總電壓時間積高 ? BioRad公司膠條總的電壓時間積為 7cm 8～ 35 kVH, 11cm 15～ 60 kVH, 17cm 25～ 100 kVH 等電聚焦條件 Step 1 Step 2 Step 3 total voltage Time VoltHours Ramp 250 20min －－－ Linear 4000 4000 2hr －－－ －－－ 10,000Vhr Linear Rapid 5 hr 14,000Vhr 7 cm Step 1 Step 2 Step 3 total total Step 1 Step 2 Step 3 11 cm 17 cm 250 250 8000 10000 10000 8000 20min 20min －－－ －－－ －－－ －－－ －－－ －－－ 20,000Vhr 40,000Vhr ～ 30,000Vhr ～ 50,000Vhr hr 7 hr Linear Linear Linear Linear Rapid Rapid Protean IEF的聚焦設(shè)置和結(jié)果 pH 4 7 兩維間的平衡 ? 一維結(jié)束后可馬上進行二維電泳，也可保存在兩片塑料膜間于－ 80176。 保存數(shù)月。 ? 但在二維電泳前一定要進行膠條的平衡，以便于被分離的蛋白質(zhì)與 SDS完整結(jié)合，從而在 SDSPAGE時電泳能順利進行。 平衡條件的選擇 ? 平衡液：用含 2%(m/v)SDS、 1%(m/v)DTT、 6mM尿素和30%甘油的 50mM Tris（ ）緩沖液先平衡 15min，再用5%(m/v)碘乙酰胺（ IAA）取代 DTT后的上述緩沖液平衡15min。 ? 尿素和甘油可增加溶液粘度，減少電內(nèi)滲。電內(nèi)滲作用是由固相化的兩性電解質(zhì)造成的，它影響蛋白質(zhì)從第一向到第二向的轉(zhuǎn)移 ? SDS用于變性蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)帶上負電荷，這對第二向 SDSPAGE來講是十分重要的 ? DTT和 IAA分別用于打開和烷基化封閉蛋白質(zhì)的二硫鍵 ? 溴酚藍用來檢測電泳過程 ? 兩次平衡的時間均為 15分鐘，如果圖譜的豎直條紋較多平衡時間可適當(dāng)延長到 20分鐘，時間太短蛋白質(zhì)沒有被 SDS充分包裹，容易產(chǎn)生水平條紋。 第一向到第二向的轉(zhuǎn)移 ? 3T%的 IPG膠條可以看作為壓縮膠，所以一般只使用分離膠，但也有人用壓縮膠。 ? IPG膠條平衡好后，一般將膠條在電泳緩沖液里浸潤一下 ? 可以清洗膠條，去除膠條上的平衡液 ? 潤濕的膠條容易沿著玻璃板推到 SDSPAGE凝膠上 ? IPG膠條轉(zhuǎn)移到 SDSPAGE膠有兩種方式 ? 先將 IPG膠條放到 SDSPAGE膠上，再加入熔化的瓊脂糖溶液。圖譜不易變形，但在兩塊膠之間容易有小氣泡產(chǎn)生。相比之下，氣泡對圖譜的影響較小，故為推薦方式 ? 先加入熔化的瓊脂糖溶液，再將 IPG膠條放到 SDSPAGE膠上。非常好地解決了膠之間的氣泡問題，但瓊脂糖容易凝固，插入 IPG膠條時有時會造成圖譜變形。 聚丙烯酰胺凝膠 （ polyacrylamide gel,PAG） ? 聚丙烯酰胺凝膠 （ polyacrylamide gel, PAG ） 由單體 丙烯酰胺 （ acrylamide， Acr） 和交聯(lián)劑 N， N’甲叉雙丙烯酰胺（ N， N’methylenebisacrylamide, Bis） 聚合而成 。 根據(jù)不同的分離目的，按不同濃度比例來配制PAG膠 : a、 丙烯酰胺 CH2=CHCONH2 b、 N,N’甲叉丙烯酰胺 CH2=CHCONHCH2NHCOCH=CH2 T、 2個單體的總百分濃度 C、 N,N’甲叉丙烯酰胺占兩個單體總質(zhì)量的百分比 m、凝膠聚合前的溶液體積 T=(a+b)/m 100%, C=b/(a+b) 100% (1)T值一般在 5%30%之間， T太大粘度增加， T太小凝膠脆性太大溶液破裂。預(yù)實驗取 13%,然后根據(jù)蛋白質(zhì)分子量調(diào)整T值。 (2)C值一般在 3%左右，而取 %更易于分離。 第二向分離： SDS－ PAGE原理 ? SDSPAGE：十二烷基磺酸鈉 聚丙烯酰胺凝膠電泳 ? SDS：變性劑和助溶劑 ? DTT， ?巰基乙醇 ：還原劑 ? SDS是一種陰離子去垢劑，溶液中 SDS達一定濃度濃度時，可以和蛋白質(zhì)結(jié)合，使得蛋白質(zhì)負電荷過剩，掩蓋了蛋白質(zhì)本身的電荷。 ? 蛋白質(zhì)的形狀與蛋白質(zhì)的分子量成比例。 ? 在電場作用下，各個蛋白質(zhì)的形狀決定蛋白質(zhì)的遷移率，也就實現(xiàn)了按照分子量大小進行分離。 ? 蛋白質(zhì)的遷移率與分子量的對數(shù)有線性關(guān)系。 垂直電泳設(shè)備 GE公司 Hoefer SE垂直電泳系統(tǒng) BioRad公司 PROTEAN II XL Cell垂直電泳系統(tǒng) 二維 SDSPAGE ? 同普通 SDSPAGE類似。 ? 但一般在垂直電泳系統(tǒng)中無需濃縮膠，因為在IPG膠條中蛋白質(zhì)區(qū)域已得到濃縮，可以認為非限制性 IEF膠（低濃度丙烯酰胺膠）充當(dāng)了濃縮膠。 2DE (two dimensional electrophoresis) IEF SDSPAGE