【正文】 質(zhì)譜技術(shù)原理 ? 質(zhì)譜技術(shù)是將樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子間的質(zhì)量、電荷比值（ m/z）差異來確定相對分子質(zhì)量的技術(shù)。 ? Edman降解法是用 異硫氰酸苯酯 在弱堿條件下與肽段 N端 α氨基結(jié)合生成苯氨基硫甲酰肽 (PTC肽 ），然后在酸性條件下經(jīng)環(huán)化、水解處理，生成苯乙內(nèi)酰硫氨基酸(PTHaa) 和失去原 N端氨基酸的肽。 ? 首先使經(jīng)凝膠分離的蛋白質(zhì)直接印跡在PVDF(聚偏氟乙烯 ) 膜或玻璃纖維膜上，染色、切割，然后直接置于測序儀中進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。 ? 計(jì)算機(jī)方法如相似性、聚類分析、等級分類和主要因素分析已被采用 2DE獲得的蛋白質(zhì)圖譜 （五）蛋白質(zhì)微量測序 (microsequencing) ? 傳統(tǒng)的 N末端 Edman降解是進(jìn)行鑒定的主要技術(shù)。 圖像比較 ? IPG技術(shù)的出現(xiàn)使斑點(diǎn)配比變得容易，較大程度的相似性可通過斑點(diǎn)配比向量算法在長度和平行度方面進(jìn)行觀測。 ? 多數(shù)系統(tǒng)以控制斑點(diǎn)的重心或最高峰來分析，邊緣檢測的軟件可精確描述斑點(diǎn)外觀，并進(jìn)行邊緣檢測和鄰近分析，以增加精確度。 固相 pH梯度等電聚焦 （ immobilized pH gradients isoelectric focusing,IPGIEF） ? 1988年 G A建立的一種新型等電聚焦凝膠電泳 ? 所用介質(zhì)為具有弱酸或弱堿性質(zhì)的丙烯酰胺衍生物，為一種固定化電解質(zhì)，在凝膠聚合時形成 pH梯度，不隨環(huán)境電場的改變而改變 ? 比傳統(tǒng)的 IEF具有更高的分辨率（可達(dá)），上樣量大，預(yù)制的商品化IPG膠條易于自動化操作、結(jié)果重復(fù)性好 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 十二烷基硫酸鈉（ SDS）是一種陰離子去污劑，能與蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)相結(jié)合，從而使蛋白質(zhì)獲得大量的負(fù)電荷，消除了電荷效應(yīng)，使電泳遷移率只與分子的大小有關(guān) 2DE分析的基本步驟 蛋白質(zhì) 溶解 變性 還原 去除蛋白 質(zhì)雜質(zhì) 利用不同 pK固定化 電解質(zhì)配 置不同 pH 范圍的凝 膠 利用軟件 設(shè)計(jì)配置 第一相電泳 (IPG－ IFE) 平衡 第二相電泳 (SDS－ PAGE) 考馬斯亮 藍(lán)染色 銀染色 銅染色 樣品制備 IPG膠制備 雙相電泳 染色 雙向電泳的樣品制備 樣品的預(yù)處理涉及： ?溶解、變性和還原以完全破壞蛋白間的相互作用； ?除去如核酸等非蛋白物質(zhì)； ?使用蛋白酶抑制劑，以保持蛋白質(zhì)不被蛋白酶水解； 第一向等電聚焦電泳 商品化 IPG膠條的選擇 ?大小選擇：厚 寬 長 = 3 3mm （或 1 1 18mm等） ?pH范圍選擇： 3~10； 4~7； 6~11等 寬 pH膠帶分辨率差一些，用于初篩 窄 pH膠帶分辨率較高，上樣量也較大，用于蛋白質(zhì)更精確的分離和分析 ?特殊膠帶選擇：偏酸偏堿的蛋白質(zhì) 第二向 SDS凝膠電泳 電泳凝膠的選擇： ?第二向電泳之前應(yīng)用第二向電泳緩沖液平衡第一向電泳 IPG膠帶 ?根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小選擇合適的凝膠濃度 ?為了獲得高分辨率可以加大凝膠的面積 蛋白質(zhì)染色 ? 考馬斯亮藍(lán)染色 ：利于圖譜分析，但敏感性較低 ? 銀染色 ：靈敏度高，分辨率好，但染色深淺與蛋白質(zhì)量不成比例，不利于圖譜分析 ? 熒光染色 ：應(yīng)用兩種不同的染料熒光標(biāo)記兩個樣品，使在同一凝膠上電泳后的凝膠圖象為兩個，避免了幾種 2DE的比較，可在納克級進(jìn)行檢測 ? 放射性標(biāo)記 ：不依賴其代謝的活性，僅適于對合成的蛋白質(zhì)檢測 ? 有機(jī)染料 ：不適合 PVDF膜 考馬斯亮藍(lán)染色 銀染色 銀染色顯示蛋白斑點(diǎn) 2DE的不足 極酸、極堿性蛋白質(zhì)，疏水性蛋白質(zhì)，極大、極小蛋白質(zhì)，低豐都蛋白質(zhì)難以有效分離；膠內(nèi)酶解過程費(fèi)時費(fèi)力，難以與質(zhì)譜聯(lián)用實(shí)現(xiàn)自動化。 2DE 技術(shù)原理 等電聚焦凝膠電泳 （ isoelectric focusing gel electrophoresis， IEF） 在等點(diǎn)聚焦過程中，載體兩性電解質(zhì)在電場中形成正極為酸性、負(fù)極為堿性的連續(xù)pH梯度。目前，隨著技術(shù)的飛速發(fā)展，二維電泳技術(shù)已能分離出 10 000個斑點(diǎn) (spot)。 親和層析： 第二節(jié) 蛋白質(zhì)組 鑒定分析技術(shù) （一） Western印跡雜交 基本操作步驟： 蛋白樣品的制備 SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳 蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移 蛋白質(zhì)與抗體的結(jié)合反應(yīng) 目標(biāo)蛋白質(zhì)的顯示 western 印跡基本步驟圖示 （二）雙向凝膠電泳 （ twodimensional gel electrophoresis， 2DE） ? 雙向電泳技術(shù)是蛋白質(zhì)組研究中最有效的分析鑒定技術(shù)之一 。 ? 固定相 ：結(jié)合有親和物的不溶于水的固相支持物 ? 流動相 ：含有與親和物匹配的待分離物緩沖液。 凝膠過濾層析 ? 填充劑 ：離子交換樹脂（劑），分為陰離子交換劑（帶正電荷，能結(jié)合陰離子）、陽離子交換劑（帶負(fù)電荷，能結(jié)合陽離子） ? 原理 ：帶電荷的蛋白質(zhì)由于所帶電荷數(shù)不同，對交換劑的親和力出現(xiàn)差異，通過離子交換與洗脫，使不同的離子先后被洗脫下來，達(dá)到分離的目的。凝膠顆粒形成不同交聯(lián)度的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 （三）電泳技術(shù) ? 原理 ：利用蛋白質(zhì)分子所帶電荷不同或分子大小及形狀不同，在外界電場的作用下，蛋白質(zhì)帶電粒子在電場中具有不同的泳動速率而進(jìn)行的分離。這是由于少量鹽類離子與水分子影響蛋白質(zhì)分子上的極性基團(tuán)，使其溶解度增大。能從復(fù)雜組織中選取特定的單一細(xì)胞 用于研究，使分子生物學(xué)的研究更加準(zhǔn)確 ，精細(xì)，客觀地反映發(fā)生在生物細(xì)胞中的 真實(shí)變化。 ? LCM技術(shù)粘取細(xì)胞 ：能從復(fù)雜組織中選取特定的單一細(xì)胞用于研究，客觀地反映發(fā)生在生物細(xì)胞中的真實(shí)變化。 蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)路線 第一節(jié) 蛋白質(zhì)組 分離分析技術(shù) 一、蛋白質(zhì)分離純化的一般程序 生物體組織細(xì)胞 離心技術(shù) 鹽析法 親和層析 凝膠層析 離子交換層析 電泳法 純化蛋白 材料選擇 細(xì)胞破碎 有機(jī)溶劑沉淀法 等電點(diǎn)法 （一）蛋白質(zhì)樣品的制備 ? 勻漿組織 ：組織勻漿后不同細(xì)胞類型的蛋白質(zhì)混雜在一起，最后得到的研究數(shù)據(jù)根本無法解釋蛋白質(zhì)在每類細(xì)胞中的表達(dá)情況，因此其研究結(jié)論值得懷疑。 ? 復(fù)雜性 ： mRNA的轉(zhuǎn)錄水平并不能代表蛋白質(zhì)表達(dá)水平；蛋白的多樣性和復(fù)雜性更多體現(xiàn)在翻譯后修飾。 蛋白組學(xué)研究的特點(diǎn) ? 整體性 ：基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)；各種蛋白質(zhì)其各自功能的發(fā)揮依賴于整體性；研究的策略要求整體性。 (3)在執(zhí)行生理功能時蛋白質(zhì)的表現(xiàn)是多樣的、動態(tài)的，并不像基因組那樣基本固定不變。 ?目前，蛋白組學(xué)的研究主要把目標(biāo)定位在功能蛋白質(zhì)組學(xué) 蛋白組學(xué)研究的意義 (1)生命現(xiàn)象的發(fā)生往往是多因素影響的，必然涉及到多個蛋白質(zhì)。故一個蛋白質(zhì)組不是一個基因組的直接產(chǎn)物，蛋白質(zhì)組中蛋白質(zhì)的數(shù)目有時可以超過基因組的數(shù)目。 蛋白質(zhì)組 protein + genome proteome 一種基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì) 一個細(xì)胞或一個機(jī)體的基因所表達(dá)的全部蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)組與基因組的差別 蛋白質(zhì)組隨著組織、甚至環(huán)境狀態(tài)的不同而改變。 第四章 蛋白質(zhì)組與蛋白組學(xué) proteome and proteomics DNA mRNA 蛋白質(zhì) 轉(zhuǎn)錄 翻譯 基因 蛋白質(zhì) 細(xì)胞特異性基因表達(dá) 生理狀態(tài) 蛋白質(zhì)相互作用 溫度 應(yīng)激狀態(tài) 培養(yǎng)條件 藥物作用 數(shù)量有限 結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定 復(fù)雜性 多變性 直接反應(yīng)生命現(xiàn)象 復(fù)雜的調(diào)控 蛋白質(zhì)組（ proteome） ?概念：意指 ―proteins expressed by a genome‖，即 ―一個細(xì)胞或一個組織基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì) ‖。是 21世紀(jì)自然科學(xué)的核心領(lǐng)域之一。提高藥物療效及安全性 藥物基因組學(xué) 系統(tǒng)生物學(xué) ? 系統(tǒng)生物學(xué) （ systems biology）： 是了解一個生物復(fù)雜系統(tǒng)中所有組成成分（基因、 mRNA、蛋白質(zhì)、代謝小分子等）的構(gòu)成以及在特定條件下這些組分間的相互關(guān)系，并分析該系統(tǒng)在一定時間內(nèi)的動力學(xué)過程。 環(huán)境基因組學(xué) ?人類對藥物作用存在個體差異。 ? 可使用的遺傳標(biāo)記：限制酶酶切位點(diǎn)、已知序列的 DNA片段（稱為序列標(biāo)簽位點(diǎn) sequence tagged site， STS）、特征性序列、載體連續(xù)克隆重疊群 ? 長度單位：以 DNA實(shí)際長度（ Mb、 kb）為圖距，以 DNA探針的 STS序列為路標(biāo) ? 主要內(nèi)容：構(gòu)建“片段重疊群” 序列圖譜 ? 任務(wù)：完成總長度 30億個核苷酸組成的人類基因組序列測定 ? 策略：把龐大的基因組分成若干有路標(biāo)的區(qū)域后進(jìn)行測序分析 ? 基礎(chǔ)：序列分子需要用一個區(qū)域的 DNA片段重疊群使測序工作不斷延伸，因此遺傳圖和物理圖是繪制序列圖的基礎(chǔ) （三）功能基因組計(jì)劃 基因組的研究內(nèi)容 后基因組時代 ： 人類基因組計(jì)劃的完成 基因組功能研究的開始 結(jié)構(gòu)基因組學(xué)：全基因組測序 功能基因組學(xué)：基因功能鑒定 轉(zhuǎn)錄圖譜 ? 轉(zhuǎn)錄圖譜：就是在人類基因組中鑒別出全部基因的位置、結(jié)構(gòu)和功能