蛋白質(zhì)研究技術(shù)平臺(tái)-資料下載頁(yè)
2025-05-02 05:27本頁(yè)面
【正文】 理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制，煮后變性會(huì)消失。如果抗體識(shí)別的是蛋白上連續(xù)的幾個(gè)氨基酸，也就是 線性表位 ，那么這種抗體可同時(shí)用于免疫組化和 Western，而如果抗體識(shí)別 構(gòu)象形表位 ，則只能用于免疫組化。一般抗體說明書上都有注明此種抗體識(shí)別的氨基酸區(qū)間。 ?在做 Western Blot時(shí)， PBDF膜用甲醇浸泡的目的？ ?解答： PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時(shí)多加甲醇也是這個(gè)目的。 Western blot常見問題 ?不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上， 轉(zhuǎn)移效率低怎么樣解決？ ? 解答：可以考慮：轉(zhuǎn)移緩沖液中加入 20%甲醇（是指終濃度） (優(yōu)化的轉(zhuǎn)移緩沖液，可以參考 《 蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè) 》 )，因?yàn)榧状伎山档偷鞍踪|(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和 PVDF膜的結(jié)合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對(duì)高分子量蛋白質(zhì)可延長(zhǎng)轉(zhuǎn)移時(shí)間；轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度 %SDS，也是為了增加轉(zhuǎn)移效率；用優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)移膜，或使用小孔徑的NC膜（ ）；使用戊二醛交聯(lián)；低濃度膠，如低至 6％。太大時(shí)還可以考慮用瓊脂糖膠；提高轉(zhuǎn)移電壓／電流；增加轉(zhuǎn)移時(shí)間。 Western blot常見問題 ?蛋白分子量大小分別為 21kd、 28kd，用的是濕轉(zhuǎn)，請(qǐng)問多大電流，多長(zhǎng)時(shí)間比較合適？ ?解答：分子量比較小，最好是用干轉(zhuǎn)，濕轉(zhuǎn)效率太高，易轉(zhuǎn)過了。干轉(zhuǎn)的話，用 A/cm2， 30min就應(yīng)該夠了。濕轉(zhuǎn)，按照biorad的說明，用 100mA，也得要半個(gè)多小時(shí)吧。 Western blot常見問題 ? 怎樣才能把膠跑的非常漂亮，泳道和 band都能很直 ? ? 影響跑膠跑的質(zhì)量，有以下幾個(gè)因素： 電壓，小的電壓會(huì)使膠的分子篩效應(yīng)得到充分發(fā)揮。電壓越小，條帶越漂亮，濃縮膠 80v，分離膠 100v就能跑得很好。 膠的均勻度，膠越均勻，條帶越窄，分離越均勻。倒膠之前，一定要充分混勻，玻璃板一定要干凈，雙蒸水隔離時(shí)，一定要比較輕地加上去，避免稀釋下層的分離膠。 Western blot常見問題 Western blot結(jié)果如何分析 目的蛋白 110kd
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