【正文】 防御性蛋白質(zhì)分子。 這種高度特異、高度靈敏的 抗體一抗原 結(jié)合反應(yīng)現(xiàn)在被廣泛地應(yīng)用于 檢測(cè)微量蛋白 的存在情況。 106 目前應(yīng)用 抗體 研究蛋白質(zhì)的方法主要包括下面幾種： １ .蛋白質(zhì)印跡 2. 免疫共沉淀 107 (一）蛋白質(zhì)印跡 （ Western blotting） 是一種使用廣泛的檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法。 這種方法與研究核酸時(shí)用的印跡法原理非常類似－－ 蛋白質(zhì)印跡法 是利用抗原一抗體之間的特異結(jié)合反應(yīng)而檢測(cè)的； 核酸類的印跡法 是利用核酸分子之間通過(guò)特異堿基配對(duì)法則而形成雜交分子這一原理而檢測(cè)的 108 蛋白質(zhì)印跡 －－ 檢測(cè)時(shí)，蛋白質(zhì)混合物（一般是細(xì)胞抽提物）通過(guò)電泳被分開(kāi)，蛋白質(zhì)被（一般通過(guò)電場(chǎng)的作用）轉(zhuǎn)移到一種特別的膜（如硝化纖維膜等）上，然后讓特異的抗體與固定在膜上的特異抗原蛋白結(jié)合 抗原一抗體之間結(jié)合的 高度特異性 使得用某種蛋 白質(zhì)分子制備的特異抗體分子只與膜上的這種蛋白質(zhì)分子結(jié)合，而不與膜上存在的成千上萬(wàn)種其他蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用。 109 結(jié)合了特異抗體的蛋白質(zhì)條帶可以通過(guò)能與結(jié)合在抗原蛋白上的所謂 “ 第一 ” 抗體結(jié)合的、被一種特異的酶／化學(xué)發(fā)光基團(tuán)／熒光基團(tuán)／放射性同位素標(biāo)記的 “ 第二 ” 抗體進(jìn)行顯示。 這樣我們可以知道與特異抗體對(duì)應(yīng)的抗原蛋白在檢測(cè)的蛋白混合物中是否存在？相對(duì)量是多少？如果蛋白混合物是通過(guò) SDSPAGE分開(kāi)的話，被檢測(cè)蛋白的分子量也一目了然。 110 （二）免疫共沉淀 （ coimmunoprecipitation） 是一種在體外 探測(cè)兩個(gè)蛋白分子之間 是否存在特異 相互作用的方法。 免疫共沉淀的原理：如果兩個(gè)蛋白在體外系統(tǒng)中能夠發(fā)生特異相互作用的話，那么當(dāng)用兩個(gè)蛋白中的一個(gè)所對(duì)應(yīng)的抗體進(jìn)行免疫沉淀的時(shí)候，另一個(gè)蛋白也將同時(shí)被沉淀下來(lái)。 111 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析 112 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)包括： 共價(jià)結(jié)構(gòu)和非共價(jià)結(jié)構(gòu) 靜態(tài)結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)。 一級(jí)結(jié)構(gòu) 空間結(jié)構(gòu) 113 一、氨基酸序列測(cè)定－一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定其高級(jí)結(jié)構(gòu)，測(cè)定一個(gè)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)是我們認(rèn)識(shí)一個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的前提之一。 114 ?Edman降解法：是肽鏈或蛋白質(zhì)中 N端氨基酸序列分析方法之一。由菲爾 埃德曼（ Pehr Edman）首先創(chuàng)立。 ?質(zhì)譜技術(shù)－－基于串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的ＡＡ測(cè)序方法 是根據(jù)質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定多肽分子質(zhì)量的極高準(zhǔn)確性 這一特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的 ?通過(guò)測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸所對(duì)應(yīng)的 DNA編碼序列上 讀出（從 cDNA序列直接讀出，或從對(duì)應(yīng)的基因組DNA序列中的外顯子序列） 115 Edman降解法： 原理： 用異硫氰酸苯酯（ PITC）與待分析多肽的 N端氨基在堿性條件下反應(yīng)，生成苯氨基硫代甲酰胺（ PTC）的衍生物，然后用酸處理，關(guān)環(huán)，肽鏈 N端被選擇性地切斷，得到N端氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接著用有機(jī)溶劑將該衍生物萃取出來(lái)，酸作用下，該衍生物不穩(wěn)定，會(huì)繼續(xù)反應(yīng)，形成一個(gè)穩(wěn)定的苯基乙內(nèi)酰硫脲（ PTH）衍生物。余下肽鏈中的酰胺鍵不受影響。通過(guò)用 HPLC或電泳法分析生成的苯乙內(nèi)酰硫脲（ PTH氨基酸），可以鑒定出是哪一個(gè)氨基酸。每反應(yīng)一次，結(jié)果是得到一個(gè)去掉 N端氨基酸殘基的多肽，剩下的肽鏈可以進(jìn)入下一個(gè)循環(huán)，繼續(xù)發(fā)生降解。 116 優(yōu)點(diǎn)： 能夠可靠地測(cè)定肽鏈的 30個(gè)左右氨基酸殘基序列，最多可以分析 5060個(gè)氨基酸殘基。在最好的條件下，每形成一次 PTH氨基酸，效率可保持在 99%以上。而且此法用量少， 缺點(diǎn)： 由于 Edman降解是以化學(xué)試劑對(duì) N端氨基的修飾為基礎(chǔ)的，因此當(dāng) N端被其他化學(xué)基團(tuán)所封閉時(shí)，就需要先去除這些基團(tuán)，然后才能進(jìn)行測(cè)序。此外，蛋白質(zhì)中含有半胱氨酸殘基時(shí)，有時(shí)兩個(gè)半胱氨酸殘基會(huì)發(fā)生二硫鍵交聯(lián)。這種情況下，需要先用過(guò)酸將二硫鍵氧化為 –SO3H，然后才能用 Edman降解測(cè)定序列。 質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定ＡＡ序列： １ .先測(cè)定某一肽段（如： AB CDEFG ）以及從 C一末端或 N一末端去除一個(gè)殘基的同一肽段（如： BCDEFG）各自的 分子質(zhì)量 ，二者之差值即為末端殘基（ A）的分子質(zhì)量。 2. 然后與 20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的分子量進(jìn)行比較 就可以確定末端氨基酸的本質(zhì)了。 在實(shí)際操作的時(shí)： 從質(zhì)譜上得到的是一系列的多肽片段， 每對(duì)大小相近的片段之間僅僅相差一個(gè)氨基酸殘基。 根據(jù)這一分子量差值的大小，較大肽段的末端殘基即可準(zhǔn)確判斷。換句話說(shuō)，從獲得的一系列依次相差一個(gè)殘基的肽段的分子質(zhì)量中我們很快就可以確定最初樣品多肽的末端序列（從 N一末端或 C一末端開(kāi)始） 。 118 二、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的測(cè)定 最為成熟的方法是： X一射線晶體衍射法 1953年 J. D. Watson和 F. H. C. Crick根據(jù) X射線衍射實(shí)驗(yàn)建立了脫氧核糖核酸 (DNA) 的雙螺旋結(jié)構(gòu) .獲得了 1962年的諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng) . 另一項(xiàng)是用 X射線衍射分析方法測(cè)定肌紅蛋白和血紅蛋白晶體結(jié)構(gòu)的工作 。 另一個(gè)方法為磁共振（ NMR) X射線晶體衍射法 基本原理： 首先 ，純化的蛋白質(zhì)分子在合適的環(huán)境中進(jìn)行高度有序的排列 而形成所謂的單晶（ single crystals)； 然后， 用一束 X射線（波長(zhǎng)為 ）照射蛋白 晶體中按同樣方式排列的巨大數(shù)目的蛋白分子。 結(jié)果， 一部分射線將在與蛋白分子中精確排列原子的電子云發(fā)生 相互作用后散射（ scatter )，或說(shuō)衍射 diffraction )。 在距離蛋白晶體一定的位置放置一個(gè)對(duì) X一射線敏感的電子探 測(cè)器（ detector)，則可以得到一個(gè)反映蛋白質(zhì)分子中不同原子 排列方式的衍射圖（ diffraction pattern )。通過(guò)利用計(jì)算機(jī) 軟件處理后轉(zhuǎn)換成一電子密度圖，根據(jù)所得到的電子密度圖即可 解出晶體蛋白分子中的每一個(gè)原子的排列方式。 120 三、蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的追蹤 蛋白質(zhì)分子在折疊、去折疊過(guò)程中，在與其他分子發(fā)生相互作用的時(shí)候都會(huì)發(fā)生構(gòu)象的調(diào)整。這些變化一般可通過(guò)圓二色譜 ( circular dichroism, CD）等方法來(lái)探測(cè)。 紅外光譜（ Infrared spectroscopy )、拉曼光譜( Raman spectroscopy )、電子自旋共振 ( electron spin resonance, ESR )等也都可以從不同角度對(duì)蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的變化進(jìn)行定性或 （和）定量探測(cè)。 121 四、蛋白質(zhì)分子的生物功能研究 （一）基因敲除技術(shù) 利用重組 DNA技術(shù)將編碼某種蛋白的基因從有機(jī)體基因組中敲除掉，觀察缺失該蛋白的個(gè)體出現(xiàn)的表型變化，然后 再推測(cè)蛋白在體內(nèi)的可能功能。 （二）細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù) 將編碼某種蛋白質(zhì)的目的基因（真核生物中一般使用的是對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)的 cDNA序列）插入到一 DNA載體上，使之能夠在待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生出具有活性的蛋白質(zhì)分子。然后觀察轉(zhuǎn)染后，所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)對(duì)被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的行為的影響。并進(jìn)而推測(cè)蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的可能功能。 122 （三）酵母雙雜交系統(tǒng) （ yeast twohybrid system） 是通過(guò)遺傳學(xué)方法鑒定兩個(gè)蛋白質(zhì)分子之間在酵母細(xì)胞內(nèi)是否發(fā)生特異相互作用的有效手段。 若兩個(gè)蛋白質(zhì)發(fā)生這種特異的相互作用的話，那么可以認(rèn)為它們之間的功能可能存在某種相關(guān)性。 如果相互作用的兩個(gè)蛋白質(zhì)分子中有一個(gè)的功能已知的話，那么就為我們認(rèn)識(shí)另一個(gè)蛋白分子的生物功能提供了重要的暗示。 123 124 蛋白質(zhì)研究方法復(fù)習(xí)題 蛋白質(zhì)的分離純化過(guò)程。 。鹽溶 鹽析 。簡(jiǎn)述常用作凝膠的載體物質(zhì)的種類 5. 等電取焦電泳的原理 Edman降解法 。