【正文】 等電聚焦電泳 免疫電泳等 80 自由電泳 以 溶液 為介質，在溶液中將蛋白質分離 缺點 :自由電泳過程中擴散嚴重，分辨率有限 區(qū)帶電泳 在固體支持物上所進行的電泳． 固體支持物有 :濾紙、 醋酸纖維薄膜、 瓊脂糖凝膠 聚丙烯酰胺凝膠 優(yōu)點 :分辨率很高。 所以一般情況下，溶液在 280nm波長處（屬紫外 光范圍）的光吸收能力被當做是 存在 蛋白質的證據。 75 蛋白質的檢測和鑒定 76 一般可通過以下幾個方面進行： 光譜學特性 電泳行為 特異抗體反應 特異生物學活性 N一末端氨基酸序列測定 質譜檢測 排阻層析 77 一、光譜學特性 光譜特性的總原則是 ： 當一定波長的光（即電磁波）與 Pr分子接觸時，所吸收的或反射的輻射能量與 Pr分子結構特征和濃度是密切相關的。在離子交換 HPLC中，固定相多用離子性鍵合相，故本法又稱離子性鍵合相層析。另一種利用離子對原理的液 液分配層析為離子對層析。將固定液的官能團結合在薄殼或多孔型硅膠上，經酸洗、中和、干燥活化、使表面保持一定的硅羥基。液 固吸附層析中的流動相依其所起的作用不同，分為“底劑”和洗脫劑兩類，底劑起決定基本色譜的分離作用，洗脫劑起調節(jié)試樣組份的滯留時間長短，并對試樣中某幾個組份具有選擇性作用。 68 HPLC包括： 輸液系統(tǒng)： 驅動流動相和樣品通過色譜分離柱和檢測系統(tǒng) 層析柱： 分離樣品中的各個物質 進樣器： 將待分析樣品引入色譜系統(tǒng) 檢測系統(tǒng)： 將被分析組在柱流出液中濃度的變化轉化為光學或電學信號 ，并分析顯示出來 69 70 71 分 類 (1)液一固吸附層析 (2)液一液分配層析 ： 是應用最多的方法之一。 常用載體 ： 纖維素、 葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、 聚丙烯酸胺凝膠和多孔玻璃 等 。 64 固定相 配基 固定在 固相載體 上 65 66 ：具有高度的吸附專一性 層析過程簡便、快速 ： (1)必須具有高度親水性，使 Pr分子容易與它接近 . (2)非專一性吸附要十分小。 如， 酶的活性部位能和底物 \抑制劑 \輔助因子專 一性地結合 ,改變條件又能使這種結合解除 . [酶的變構中心與變構因子（或稱效應物）之 間、抗體與抗原之間、激素與受體之間，結 合蛋白與結合物之間 ]。因此在高濃度的這些鹽溶液中應用羥基磷灰石進行層析時，可以專門吸附酸性蛋白質及中性蛋白質而排除堿性蛋白質。 ２ . 磷酸基團與 Pr正電荷基團 62 流動相 ： 洗脫劑 檸檬酸鹽 作用：檸檬酸離子因與 Ca2+有更強的相互作用， 它能大大 降低 蛋白質和凝膠的吸附能力。 ，吸附劑容易獲得，價格較低廉 61 固定相 ： 吸附劑 —磷酸鈣凝膠 磷酸鈣膠 Ca3（ PO4） 2 磷酸氫鈣膠 CaHPO4 59 凝膠排阻層析的應用： (分子量差別大的物質 ) (Sephadex G25) (不穩(wěn)定的高分子 ) (DEAEA25) 60 吸附層析法 原理： 柱層析中，含有 Pr分子的混合物隨流動相通 過由 吸附劑 組成的固定相時， Pr分子通過各 種次級作用能夠吸附在吸附劑上 ,由于不同分 子的吸附能力不同，可以通過洗脫使它們逐 一解脫出來，而使混合物得以分離。這樣，較大的分子被先 洗脫下來，而較小的分子后被洗脫下來，從而 達到相互分離的目的 . 56 用作凝膠的載體物質有三類 ： ? 交聯(lián)葡聚糖凝膠 商品名為 Sephadex G ? 聚丙烯酰胺凝膠 商品名為 Biogel P (丙烯酰胺 + N， N’次甲基二丙烯酰胺聚合而成 P值表示不同的交聯(lián)度 ) ? 瓊脂糖凝膠 商品名為 Sepharose或 Biogel A （ 從海藻瓊脂中分離除去瓊脂膠后的中性級成分 是 D半乳糖和 3,6脫水 L半乳糖相間重復結 合而成的鏈狀化合物） 57 常用過濾層析凝膠的截留分子量范圍58 瓊脂糖凝膠優(yōu)點： 膠好得多。 當分子大小不同的混合物通過這種凝膠柱時， 直徑大于孔徑的分子將不能進入凝膠內部， 便直接沿膠粒間隙流出（全排出）。 缺點： 它的床體積常受 PH或鹽濃度影響而變化，對分離 效果有一定程度的干擾。 54 ?葡聚糖的離子交換樹脂 :骨架為三維網狀結構 優(yōu)點 ： 2. 因其高度的網狀結構，所帶有的交換基團也比纖維 素多得多。 2. 提高分辨率，樣品體積應盡可能地少。含負電量小的蛋白質首先被洗脫 下來，增加陰離子濃度，含負電量多的蛋白 質也被洗脫下來，于是兩種蛋白質被分開。 C1 K = C2 *質量分配系數： 若不用濃度而用 物質的絕對量的比值 來表示，則稱為質量分配系數即： Vs D= K Vm Vs : 固定相的體積 Vm : 流動相的體積 49 種類： 氣相層析 按 兩相狀態(tài) 來分 液相層析 吸附層析 分配層析 按 層析機理 來分 離子交換層析 凝膠排阻層析 親和層析 柱層析 按 操作方式 來分 薄層層析 紙層析 層析法分離、純化 ： Pr、 多肽和 AA 50 離子交換層析法 *原理： 陰 （陽）離子交換樹脂顆粒（作為固定相） 填充在層析柱內，由于 陰 （陽）離子交換樹 脂顆粒上帶 正 （負）電荷，能吸引溶液中的 陰 （陽）離子。 46 (二） 蛋白質的層析分離法 （色譜法） 最基本的特征： 固定相 流動相 47 原理 — 各種物質得以分離的最基本原因：就在于它們在這 兩個相之間具有不同的分配系數 .兩相作相對運動時， 這些物質在兩相間進行多次的分配，即使它們的分 配系數只有微小的差異，通過這個過程也能得到最 大的分離效果。故操作時要求條件比鹽析嚴格。蛋白質被丙酮沉淀后，應立即分離，否則蛋白質會變性。因此用有機溶劑沉淀蛋白質時應在低溫條件下進行。這種復合物在有機溶劑中往往使 Pr 溶解度變小。 一般 ∠ 。 44 （ 3）離子強度 中性鹽的加入能促使 Pr在有機溶劑中溶解， 并且能防止 Pr的變性。 [Pr]越高 ,Pr分子間作用引起的共沉淀現(xiàn)象也顯著 增強，這樣分離效果差，不利于分級沉淀。 （ 2）蛋白質濃度 [Pr]越高，加入一定量有機溶劑后， Pr析出越多。 （ 2） 有機溶劑 本身的水合作用會破壞 Pr表面的水合層，也 促使