【導(dǎo)讀】園藝植物生物技術(shù)，鄧秀新、胡春根主編。高等教育出版社，2020. 與要求通過本課程的學(xué)習(xí)，要求園藝專業(yè)學(xué)生掌握?qǐng)@藝植物生物技術(shù)相關(guān)基本理論和方法。3次實(shí)驗(yàn)課，分別為實(shí)驗(yàn)室布局/大型生物技術(shù)儀器介紹、組織培養(yǎng)技術(shù)、DNA鑒定技術(shù)。掌握生物技術(shù)的概念、所包含的技術(shù)內(nèi)容、對(duì)園藝科學(xué)發(fā)展的貢獻(xiàn)及可能引起的深。各種技術(shù)的總稱，包括細(xì)胞水平、分子水平兩個(gè)大的層面。1838-1839年，Schleiden和Schuwann提出植物和動(dòng)物均由細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞進(jìn)行分裂而。增多，并組建成生物體的―細(xì)胞學(xué)說‖；同時(shí)指出，若提供的條件同在活體內(nèi)一樣，每個(gè)細(xì)胞應(yīng)該能獨(dú)立生存和發(fā)展。1898年德國(guó)植物生理學(xué)家Haberlandt試圖通過實(shí)驗(yàn)證明該學(xué)說，于1902年發(fā)表了植物。概念直到1971年煙草單細(xì)胞培養(yǎng)成功才得到完全證明并成為理論。該結(jié)果促進(jìn)了多細(xì)胞組織和器官的培養(yǎng)研究與應(yīng)用。1960年Morel培養(yǎng)蘭花莖尖獲得再生植株，并證明脫除了病毒。該結(jié)果催生了蘭花工。直到今天，世界蘭花種苗基本上通過組織培養(yǎng)生產(chǎn)。

　　

【正文】 ange themselves in lines between the electrodes to form pearlchain. They are then subject to a high voltage discharge which causes their membranes to fuse where they are in contact. Fusion parameters Alternate current voltage (交流電壓 ) Time duration of AC (交變電場(chǎng)處理時(shí)間 ) Direct current voltage (直流高頻電壓 ) Pulse width (脈沖寬度 ) No. of Pulses (脈沖次數(shù) ) Factors affecting PP fusion ? PP quality (intact, viability etc) ? Fusion method (PEG or electro) ? Fusion parameters (電融合參數(shù)、溶液濃度等 ) SH Identification ? Morphology: leaf shape, thickness, stoma density amp。 number ? Cytology：： Chromosome numbers, flow cytometry, FISH/GISH ? Isozyme ? Molecular markers: RAPD, RFLP, RAPD, SSR etc. 體細(xì)胞雜交技術(shù)的應(yīng)用 ? To circumvent biological barriers to create novel germplasm (克服生殖障礙，創(chuàng)造新種質(zhì) ) ? To transfer beneficial traits to improve crop quality (轉(zhuǎn)移有益性狀，改良作物品質(zhì) ) ? To transfer partial chromosomes to produce asymmetric hybrids (轉(zhuǎn)移部分染色體，創(chuàng)造非對(duì)稱雜種 ) ? To transfer cytoplasmic genome to create cybrids (轉(zhuǎn)移胞質(zhì)基因組，創(chuàng)造胞 20 質(zhì)雜種 ) ? To serve as bridge material for further improvement amp。 breeding 作業(yè)布置； 原生質(zhì)體培養(yǎng)有何意義？ 原生質(zhì)體培養(yǎng)影響因素有哪些？ 體細(xì)胞融合與自然生殖過程的融合有何異同？ 如何增強(qiáng)體細(xì)胞融合過程雙親遺傳物質(zhì)的選擇性分配？ 課后自我總結(jié)分析 ： 內(nèi)容較多，應(yīng) 側(cè)重原生質(zhì)體培養(yǎng)、融合原理與方法以及體細(xì)胞雜種的主要應(yīng)用，輔以典型實(shí)例，避免過多介紹柑橘體細(xì)胞雜交。 注：板書設(shè)計(jì)可在授課進(jìn)程中直接用橫線、浪線等標(biāo)示出。 21 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)教案（課時(shí)備課） 第 89 次課 4 學(xué)時(shí) 課目、課題 （章節(jié)） 第四章 病毒病檢測(cè)與脫除 主要 參考資料 ? 鄧秀新 胡春根主編 園藝植物生物技術(shù) 高等教育出版社 2020。 ? 植物生物技術(shù)導(dǎo)論 (許亦農(nóng) 麻密 譯 ) 化學(xué)工業(yè)出版社 ? 肖尊安 植物生物技術(shù) 化學(xué) 工業(yè)出版社 教學(xué)目 的 和要求 了解園藝生產(chǎn)中存在的病毒病類型與檢測(cè)方法 了解病毒脫除的原理與技術(shù)方法 重 點(diǎn) 難 點(diǎn) 病毒病脫除技術(shù)； 病毒病的類型與分子檢測(cè)方法 教學(xué)進(jìn)程 （含 教學(xué)內(nèi)容、 教學(xué)方法、 輔助手段、 師生互動(dòng)、 學(xué)時(shí)分配、 板書設(shè)計(jì)） 第第 一一 節(jié)節(jié) 園園 藝藝 植植 物物 病病 毒毒 病病 一一 病病 毒毒 的的 定定 義義 ? 病毒的定義：是一類沒有細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，但有遺傳復(fù)制等生命特征，主要由核酸和蛋白質(zhì)組成的大分子生物。病毒個(gè)體相當(dāng)微小，大多數(shù)病毒在 100～ 300毫微米之間。 ? 病毒是結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的微小生 命體，病毒粒體有各種不同形狀，由一種核酸（ RNA或DNA） ‖和外面的蛋白質(zhì)（或脂蛋白質(zhì)）衣殼所組成，并且在適宜的條件下至少可以在一種寄主上引起病害。 ? 病毒是傳染性寄生物，它的核酸基因組的重量小于 3 108道爾頓，需要有寄主細(xì)胞中的核糖體和其它成分才能增殖。 二二 園園 藝藝 植植 物物 病病 毒毒 病病 的的 發(fā)發(fā) 生生 及及 危危 害害 特特 點(diǎn)點(diǎn) （（ 一一 ）） 園園 藝藝 植植 物物 病病 毒毒 病病 的的 侵侵 染染 特特 性性 ? 與真菌和細(xì)菌病害不同，病毒多為 系統(tǒng)性侵染 （ systemic infection）， 即病毒侵染后很快擴(kuò)展至植物的全身，因此，從帶有病毒的植株上取接穗或插條繁育的苗木，也帶有病毒。 ? 潛伏侵 染 （ latent infection）， 這類病毒稱為 潛隱病毒 （ latent virus）。 （（ 二二 ）） 園園 藝藝 植植 物物 病病 毒毒 病病 的的 發(fā)發(fā) 生生 及及 危危 害害 特特 點(diǎn)點(diǎn) 四四 重重 要要 的的 園園 藝藝 植植 物物 病病 毒毒 及及 類類 似似 病病 原原 可引起植物的系統(tǒng)性發(fā)病表現(xiàn)特有癥狀外，有的其它病原引起的病害，也表現(xiàn)相似的發(fā)病特點(diǎn)，通常將病毒及這類病原引起病害統(tǒng)稱為病毒類病害。 ? 病毒 （ virus） ? 類病毒（ viroid） ? 植原體（ phytoplasma） ? 螺原體（ spiroplasma） ? 韌皮部及木質(zhì)部限制性細(xì)菌等。這類病原引起的病害發(fā)病規(guī)律相似，均可通過嫁接傳染，許多還可經(jīng)由介體 昆蟲傳播，在防治策略上也有相同之處。 22 五五 園園 藝藝 植植 物物 病病 毒毒 病病 的的 防防 治治 （一）防治策略 ? (1)栽培無病毒苗木 ? (2)加強(qiáng)檢疫 ? (3)防治傳毒蟲媒 ? (4)抗病毒基因工程 （二）抗病毒基因工程 將外源基因?qū)胫参?，使植物獲得抗病性。一個(gè)重要的策略就是利用來源于病毒本身的基因，這種通過將病原物基因?qū)胫参锒@得的抗病性稱為病原獲得抗病性（ Pathogen acquired resistance， PAR）。 ? 外外 殼殼 蛋蛋 白白 (coat protein)基基 因因 介介 導(dǎo)導(dǎo) 的的 抗抗 性性 ? 病病 毒毒 復(fù)復(fù) 制制 酶酶 基基 因因 ? 運(yùn)運(yùn) 動(dòng)動(dòng) 蛋蛋 白白 基基 因因 ? RNA 介介 導(dǎo)導(dǎo) 的的 抗抗 性性 策策 略略 ? 衛(wèi)衛(wèi) 星星 RNA,缺缺 陷陷 干干 擾擾 RNA ,反反 義義 RNA和和 RNAi 第第 二二 節(jié)節(jié) 病病 毒毒 鑒鑒 定定 及及 檢檢 測(cè)測(cè) 技技 術(shù)術(shù) ? 生物學(xué)鑒定 ? 血清學(xué)鑒定 ? 核酸分析 一一 生生 物物 學(xué)學(xué) 鑒鑒 定定 ? 植物病毒都有一定的寄主范圍，并在某些寄主植物上表現(xiàn)特定的癥狀，這種能鑒別某種病毒的植物通常稱為指示植物或鑒別寄主。有些鑒別寄主對(duì)病毒的侵染易產(chǎn)生枯斑，因此將產(chǎn)生枯斑的寄主也稱為枯斑寄主。 ? 鑒別寄主可以是草本和木本植物。常用的接種方法包括汁液摩擦接種和嫁接傳染。 （（ 一一 ）） 草草 本本 指指 示示 植植 物物 鑒鑒 定定 ? 植物種類，常用的有藜科、茄科、豆科、葫蘆科等植物。 ? 接種方法 汁液 摩擦法，從待檢植株上取一定的組織，包括葉片、花瓣、根、或枝皮，加入 2~5倍（ V/W） 的提取緩沖液，在低溫條件下研磨，然后蘸取汁液在撒有金剛砂的供試指示植物葉片上輕輕摩擦，接種完畢立即用蒸餾水沖洗凈葉片上殘留的汁液。然后將指示植物放在 22~28℃、半遮蔭的條件下生長(zhǎng)，定期觀察并記錄指示植物的癥狀反應(yīng)。 （（ 二二 ）） 木木 本本 指指 示示 植植 物物 鑒鑒 定定 ? 常用木本指示植物 ? 接種方法 （ 1）雙重芽接法 （ 2）雙重切接法 （ 3）指示植物直接嫁接法 二二 血血 清清 學(xué)學(xué) 檢檢 測(cè)測(cè) ? 抗原（ antigen）： 凡注射到動(dòng)物體內(nèi)能刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的物質(zhì)均可稱為抗原。 ? 抗原刺激動(dòng)物機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)而產(chǎn)生抗體的特性叫 免疫原性 ； 23 ? 抗原能與所產(chǎn)生的抗體發(fā)生特異性結(jié)合，這種特性叫 反應(yīng)原性 ； ? 抗原性 上述二者合稱。 ? 兼具這兩種特性的抗原物質(zhì)稱為 完全抗原 ；只有反應(yīng)原性，沒有免疫原性的抗原物質(zhì)稱為 半抗原 。 （（ 一一 ）） 植植 物物 病病 毒毒 抗抗 血血 清清 制制 備備 (1) 病毒抗原的分離純化與制備 ? 從感染病毒的寄主植物中，通過物理和化學(xué)的方法，將病毒與寄主植物的各種組分分離，以獲得純凈的病毒制品。 ? 病毒抗原的制備方法，主要步驟包括分步沉淀 、差速離心和梯度離心等 ,去雜質(zhì)濃縮病毒。 （（ 二二 ）） 植植 物物 病病 毒毒 抗抗 體體 制制 備備 （ 1）植物病毒抗血清制備 用純化的病毒抗原免疫注射動(dòng)物獲得。常用動(dòng)物為家兔，一般選用半周歲左右、體重 2－ 3千克、健康、自然抗體陰性的日本大耳兔和半耳垂家兔 .以上方法制備的抗血清含有多種抗體，這些抗體是由動(dòng)物的多種淋巴細(xì)胞所產(chǎn)生的，因此也稱為多克隆抗體（ Polyclonal antibody， Pab） (2) 單克隆抗體 單克?。?Monoclone） 即是單一的無性細(xì)胞系，或稱單細(xì)胞系。單克隆抗體就是由免疫動(dòng)物的單細(xì)胞系所產(chǎn)生的抗體。 （（ 三三 ）） 常常 用用 血血 清清 學(xué)學(xué) 檢檢 測(cè)測(cè) 方方 法法 （ 1)免疫電鏡技術(shù)（ Immunoelectron microscopy， IEM） 是將抗原與抗體的?；悦庖叻磻?yīng)與電鏡觀察相結(jié)合的一種病毒檢測(cè)方法。其操作簡(jiǎn)便、結(jié)果判斷直觀。 抗原吸附→免疫修飾→染色→透射電鏡觀察 (2) 酶聯(lián)免疫吸附分析（ Enzymelinked Immunosorbent Assay， ELISA） 酶酶 聯(lián)聯(lián) 免免 疫疫 吸吸 附附 分分 析析 （（ Enzymelinked Immunosorbent Assay， ELISA）） ? 具有檢測(cè)靈敏度高 、 快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，不需要 提純病毒，可在較短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)大量樣品。 直接法 即所用酶標(biāo)抗體為病毒特異抗體，因此針對(duì)不同抗體需分別進(jìn)行標(biāo)記； 間接法 所用酶標(biāo)抗體為通用的市售抗體，如：羊抗兔酶標(biāo)抗體、羊抗鼠酶標(biāo)抗體等，因此無需對(duì)每一抗體進(jìn)行標(biāo)記 雙雙 抗抗 體體 夾夾 心心 法法 （（ Double antibody sandwich ELISA， DASELISA）） ? 是一種直接法。首先用病毒特異性抗體（ IgG） 包被微板孔，然后加入待檢樣品粗提液，使包被的抗體捕捉樣品中的病毒粒子，再加入酶標(biāo)抗體，最后加入底物，室溫避光放置一定時(shí)間后，判斷結(jié)果 A蛋蛋 白白 酶酶 聯(lián)聯(lián) 免免 疫疫 吸吸 附附 法法 （（ Protein A sandwich ELISA， PASELISA）） ? 為一種間接法。首先用 A蛋白包被微板的孔，然后加入病毒的抗體，再加入待檢樣品粗提液，經(jīng)第二層抗體與病毒結(jié)合，加入酶標(biāo)記 A蛋白，最后加入底物，室溫避光放置一定時(shí)間后，判斷結(jié)果。 (3)直直 接接 組組 織織 免免 疫疫 雜雜 交交 分分 析析 （（ Direct tissue blot immunoassay， DTBIA）） ? 也稱組織免疫印跡 ELISA（ Tissue printing ELISA） 分析，是 ELISA的另一形式，其原理與 ELISA相似，所不同的是用一種特殊的薄膜代 替常規(guī)的微量板作固相支持物，酶催化底物反應(yīng)產(chǎn)生的是不可溶的有色物質(zhì)沉積在帶病毒的部位，觀察有色物質(zhì)即可判斷是否帶有病毒。通過組織切面在膜上產(chǎn)生印跡，將抗原直接束縛在膜上，不需要制備或提取樣品，而且可直接提供病毒在組織中的分布信息，尤其適合于韌皮部限制性病毒的檢測(cè)，具有靈敏度高、結(jié)果可靠和快速的特點(diǎn)，該項(xiàng)技術(shù)已成功應(yīng)用于柑橘速衰病毒（ CTV） 的檢測(cè) （（ 四四 ）） 核核 酸酸 分分 析析 ? 電泳分析 在類病毒的檢測(cè)中應(yīng)用廣泛 ， 類病毒為環(huán)狀單鏈 RNA分子 ， 大小為246~375個(gè)核苷酸（ nt）， 內(nèi)部堿基高度互補(bǔ)。在自然情況下形成 棒狀或三葉草狀的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在常規(guī)電泳條件下遷移較快；在變性條件下，由于二級(jí)結(jié)構(gòu)破壞而成環(huán)狀，在電泳介質(zhì)中遷移減緩，而與其它小分子物質(zhì)分開，表現(xiàn)類病毒的特有電泳條 24 帶。因此雙向電泳也是鑒別一種病原是否為類病毒的常用技術(shù)。 ? PCR技術(shù) 病毒和類病毒的基因組成已經(jīng)明確，可以根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行PCR檢測(cè) ? 核酸雜交技術(shù) 探針 第第 三三 節(jié)節(jié) 園園 藝藝 植植 物物 病病 毒毒 脫脫 除除 技技 術(shù)術(shù) 一一 無