【正文】 片平臺的基礎(chǔ)上，比較在不同條件下聯(lián)合固氮微生物基因表達(dá)譜及其差異，研究聯(lián)合固氮基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制。分析鑒定可能參與細(xì)菌氮信號傳導(dǎo)、調(diào)控或保持最佳固氮水平的新基因和新機(jī)制。2）充分利用我國聯(lián)合固氮微生物資源優(yōu)勢，研究環(huán)境脅迫因子（如氧敏感、氨阻遏、溫度效應(yīng)等）對聯(lián)合固氮微生物根際競爭和固氮效率的影響，系統(tǒng)研究了聯(lián)合固氮體系形成的分子機(jī)理，研究聯(lián)合固氮微生物對土壤環(huán)境變化的適應(yīng)能力,探討提高作物與固氮微生物之間的聯(lián)合固氮效率的策略，利用基因工程技術(shù)改造固氮微生物，為探討穩(wěn)定聯(lián)合固氮體系建立的分子機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)。3）在固氮酶還原氮?dú)夂唾|(zhì)子的分子機(jī)制方面，利用生物信息學(xué)和結(jié)構(gòu)化學(xué)理論，分析預(yù)測Pcluster和FeMoco之間的α螺旋上單個氨基酸替換后固氮酶結(jié)構(gòu)的變化和可能對電子質(zhì)子傳遞的影響。采用分子生物學(xué)技術(shù)對固氮酶MoFe蛋白α亞單位中FeMo輔因子（FeMoco）周圍多肽環(huán)境中保守氨基酸及與FeMoco Mo端相連的高檸檬酸的定位誘變，構(gòu)建不同的突變株，研究這些突變株催化NH+ 和C2H2還原的性質(zhì)。分別研究野生型及各突變株固氮酶還原N2和H+的動力學(xué)、EPR、CD波譜、核磁、振動光譜、穆斯堡爾光譜、時間分析光譜等特征，研究固氮酶催化活性中心結(jié)合、催化底物分子的作用機(jī)理，探明底物在活性中心上存在遷移的可能性，明確N2的絡(luò)合和還原是否在FeMoco 中心硫原子（S2B）的Fe2和Fe6上，以及N2和H+還原的兩條電子質(zhì)子傳遞通道。主要研究目標(biāo)：1） 開展聯(lián)合固氮微生物比較基因組和生物固氮體系進(jìn)化研究以及在不同條件下聯(lián)合固氮微生物基因表達(dá)譜研究，揭示生物固氮進(jìn)化途徑、動力和機(jī)制，分析鑒定可能參與細(xì)菌氮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)控或保持最佳固氮水平的新基因1520個。2） 系統(tǒng)研究聯(lián)合固氮體系形成的分子機(jī)理，探討提高作物與固氮微生物之間的聯(lián)合固氮效率的新策略35種，為探討穩(wěn)定聯(lián)合固氮體系建立的分子機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)。3） 分析預(yù)測Pcluster和FeMoco之間α螺旋上單個氨基酸替換后固氮酶結(jié)構(gòu)的變化和可能對電子質(zhì)子傳遞的影響，對固氮酶MoFe蛋白α亞單位中FeMo輔因子周圍多肽環(huán)境中保守氨基酸定位誘變并構(gòu)建不同的突變株510株，明確N2的絡(luò)合和還原在靠近FeMoco 中心硫原子的Fe2和Fe6上發(fā)生，以及用于 N2和H+還原的兩條電子質(zhì)子傳遞通道。課題承擔(dān)單位：中國農(nóng)科院生物技術(shù)研究所、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)課題負(fù)責(zé)人： 燕永亮 32 博士 副研究員 中國農(nóng)科院生物技術(shù)研究所主要學(xué)術(shù)骨干：平淑珍 49 碩士 副研究員 中國農(nóng)科院生物技術(shù)研究所陳 明 46 碩士 副研究員 中國農(nóng)科院生物技術(shù)研究所林 敏 46 博士 研究員 中國農(nóng)科院生物技術(shù)研究所徐榮旗 44 博士 博士后 中國農(nóng)科院生物技術(shù)研究所陳三鳳 47 博士 教授 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)王 磊 33 碩士 講師 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)李 穎 56 碩士 教授 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)李季倫 83 院士 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)陳文新 82 院士 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)費(fèi)比例：%四、年度計劃年度研究內(nèi)容預(yù)期目標(biāo)第一年共生固氮體系中宿主植物遺傳分析系統(tǒng)、生化分析方法的建立； 根瘤菌中與共生相關(guān)的信號傳遞系統(tǒng)的新基因篩選；固氮基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控因子的突變分析；多種自然存在或擬人工構(gòu)建的聯(lián)合或自主固氮體系的遺傳分析方法的建立；建立新型聯(lián)合固氮菌斯氏假單胞菌的功能基因組學(xué)平臺的建立。獲得各種突變株、生化檢測系統(tǒng)，全基因組轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析系統(tǒng)，為后期工作奠定基礎(chǔ)；發(fā)表高水平文章10篇左右。第二年轉(zhuǎn)基因或突變的宿主植物的結(jié)瘤功能分析，參與宿主植物－根瘤菌相互作用的關(guān)鍵蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用分析；根瘤菌中與共生相關(guān)的信號傳遞系統(tǒng)的新基因突變分析；固氮基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控因子的精細(xì)結(jié)構(gòu)分析；聯(lián)合或自主固氮體系的調(diào)控模式以及在人工構(gòu)建固氮體系中的模擬分析；新型聯(lián)合固氮菌斯氏假單胞菌中固氮基因表達(dá)調(diào)控的上游信號傳遞系統(tǒng)分析。全面實施課題各項任務(wù)，進(jìn)行中期總結(jié)。爭取在項目實施前兩年發(fā)表在影響因子2以上的國際刊物上發(fā)表論文15篇第三年轉(zhuǎn)基因宿主植物的進(jìn)一步功能分析，圍繞宿主植物中與結(jié)瘤固氮相關(guān)的關(guān)鍵基因的表達(dá)譜及表型分析；根瘤菌中與共生相關(guān)的信號傳遞系統(tǒng)的新基因產(chǎn)物與已知信號及表型的關(guān)系；固氮基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控因子的分子間相互作用；人工構(gòu)建固氮體系中固氮及其相關(guān)生化活性分析；新型聯(lián)合固氮菌斯氏假單胞菌中參與固氮基因表達(dá)調(diào)控的新基因的功能及表達(dá)分析。在前兩年課題開展的基礎(chǔ)上，繼續(xù)深入研究，進(jìn)一步明確課題未來發(fā)展方向，爭取發(fā)表在影響因子2以上的國際刊物上發(fā)表論文20篇。第四年前期研究的宿主植物中與結(jié)瘤固氮相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控基因的上游或下游基因以及在不同植物里的同源基因的功能分析；根瘤菌中與共生相關(guān)的新基因產(chǎn)物與菌內(nèi)蛋白以及可能的與宿主蛋白相互作用的分析；固氮基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控因子的時空配位模式；固氮體系中能量傳遞與固氮活性的關(guān)系；基于新型聯(lián)合固氮高效菌斯氏假單胞菌的高效穩(wěn)定工程菌株的構(gòu)建。明確新基因的作用機(jī)制及轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式。明確新型微生物作物新型高效聯(lián)合固氮體系，并解釋機(jī)理。爭取發(fā)表在影響因子2以上的國際刊物上發(fā)表論文20篇。申請國內(nèi)外發(fā)明專利35個。第五年繼續(xù)分析宿主植物關(guān)鍵基因的上游或下游基因以及在不同植物里的同源基因的功能分析；把根瘤菌中與共生相關(guān)的基因功能分析，與宿主植物細(xì)胞中與共生相關(guān)的基因功能分析相結(jié)合，找出可能的專一性。固氮基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控的新模型的提出；人工固氮體系構(gòu)建的總結(jié)以及構(gòu)建更復(fù)雜體系的可行性分析；新型高效穩(wěn)定工程菌株的田間應(yīng)用分析。完成此計劃中所有環(huán)節(jié)，總結(jié)成果，整合課題研究成果，撰寫文章，并完成項目總結(jié)。爭取發(fā)表在影響因子2以上的國際刊物上發(fā)表論文20篇。申請國內(nèi)外發(fā)明專利46個。15 / 15