【正文】 向。Cas3然后會(huì)在任意方向沿著DNA作為spacer獲得復(fù)合體的一部分。第二步 crRNA合成加工 第三步 干擾（外源DNA特異降解）Type I () Cmr25與crRNA形成復(fù)合物。 捕獲Target RNA時(shí)需要Cmr1和6；Cmr4行使切割活性 。引發(fā)適應(yīng)研究的重要意義：適應(yīng)需要某一匹配病毒DNA 的spacer 。適應(yīng)過程需要被某一spacer引發(fā)至同源的外源DNA。因此CRISPRCas系統(tǒng)對(duì)抗病毒逃逸方面有重要作用與意義。l 回答了Nature (2012)關(guān)于CRISPR適應(yīng)的第一個(gè)關(guān)鍵問題，即為什么很難觀察到實(shí)驗(yàn)室菌株CRISPR對(duì)特定天然病毒的適應(yīng)過程（因通常缺乏引發(fā)spacer)。l 同時(shí)也解釋了實(shí)驗(yàn)室觀察到的極個(gè)別高效適應(yīng)（通過引發(fā)可將適應(yīng)機(jī)器高效導(dǎo)向外源DNA）和在自然環(huán)境中的可能需要的廣泛的適應(yīng)性（引發(fā)spacer無需嚴(yán)格匹配，可導(dǎo)向一大類同源病毒，并可通過次生spacer級(jí)聯(lián)放大至更多其它病毒)。l 在一定程度上為回答CRISPR適應(yīng)過程如何區(qū)分異己DNA提供了線索。 干擾與適應(yīng)的異己識(shí)別工作的意義：l 建立并統(tǒng)一了CRISPR適應(yīng)與干擾過程的異己識(shí)別模型。利用該機(jī)制，對(duì)發(fā)生突變的病毒也可迅速獲取新的spacer, 重啟干擾過程。 l 利用該機(jī)制，宿主菌貯存一定數(shù)量的spacer, 即可通過級(jí)聯(lián)識(shí)別環(huán)境中病毒的同源序列，迅速適應(yīng)環(huán)境中的其它病毒。 l 理解為什么不受控制原生適應(yīng)必需被沉默掉的客觀實(shí)事: 傷害宿主。 2 CRISPR在現(xiàn)代微生物技術(shù)中的應(yīng)用（菌株鑒定及溯源；抗病毒工程菌，基因組及合成生物學(xué)技術(shù)等等） （（ CRISPR/Cas是最近幾年出現(xiàn)的一種由RNA指導(dǎo)Cas核酸酶對(duì)靶向基因進(jìn)行特定DNA修飾的技術(shù)。它是細(xì)菌和古細(xì)菌為應(yīng)對(duì)病毒和質(zhì)粒不斷攻擊而演化來的獲得性免疫防御機(jī)制。此系統(tǒng)的工作原理是crRNA通過堿基配對(duì)與tracrRNA結(jié)合形成tracrRNA/crRNA 復(fù)合物，此復(fù)合物引導(dǎo)核酸酶 Cas9 蛋白在與 crRNA 配對(duì)的序列靶位點(diǎn)處剪切雙鏈 DNA，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組DNA序列進(jìn)行編輯；而通過人工設(shè)計(jì)這兩種 RNA，可以改造形成具有引導(dǎo)作用的gRNA (guide RNA)，足以引導(dǎo) Cas9 對(duì) DNA 的定點(diǎn)切割。））l CRISPRCas9技術(shù)應(yīng)用策略特點(diǎn)： 1)以RNADNA配對(duì)為基礎(chǔ)，可在多位點(diǎn)同時(shí)編輯 2)通過對(duì)Cas9活性修飾，可以拓展適用范圍。））） l CRISPRCas9技術(shù)的應(yīng)用：Ⅱ型CRISPR/Cas9 系統(tǒng)自出現(xiàn)以來，得到迅速而廣泛的應(yīng)用，是生物學(xué)研究歷史上類似PCR 一樣重要的技術(shù)變革。由于它具有設(shè)計(jì)簡單，容易操作和成本低廉等重要優(yōu)勢(shì)，全世界生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室都可以利用它去進(jìn)行基因編輯研究。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在基因組DNA 片段編輯中的應(yīng)用：Ⅱ型CRISPR/Cas 系統(tǒng)只需要一個(gè)Cas9 蛋白核酸酶來切割DNA 雙鏈,即為現(xiàn)在廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)基因編輯的CRISPR/Cas9 系統(tǒng)。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在基因組DNA 片段靶向編輯方面的研究和應(yīng)用，主要包括DNA 片段的刪除、反轉(zhuǎn)、重復(fù)、插入和易位，這一有效的DNA 片段編輯方法為研究基因功能、調(diào)控元件、組織發(fā)育和疾病發(fā)生發(fā)展提供了有力手段。DNA 片段靶向刪除：研究基因和調(diào)控元件的功能，可以通過刪除這一段DNA 片段來進(jìn)行探索。2013 年，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)被應(yīng)用到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，張鋒團(tuán)隊(duì)和Church 團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)位于同一條染色體上的兩個(gè)sgRNAs 對(duì)DNA 雙鏈進(jìn)行操作時(shí)，在獲得定點(diǎn)突變的同時(shí)，也存在DNA 片段刪除的情況。張鋒團(tuán)隊(duì)在EMX1 位點(diǎn)設(shè)計(jì)的相距119 bp 的兩個(gè)靶向sgRNAs 對(duì)該119 bp DNA 片段進(jìn)行了刪除。DNA 片段靶向反轉(zhuǎn)：吳強(qiáng)團(tuán)隊(duì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和小鼠中對(duì)DNA 片段反轉(zhuǎn)進(jìn)行了詳盡的研究。他們?cè)诓溉閯?dòng)物細(xì)胞中對(duì)709 bp~1 Mb 的7 個(gè)不同長度的DNA 片段進(jìn)行了有效地反轉(zhuǎn)(圖1B)；同時(shí)他們將Cas9 mRNA 和兩個(gè)靶向sgRNAs 注射到小鼠受精卵中，再將被注射后存活的受精卵移植到假孕鼠中獲得后代，篩選得到了反轉(zhuǎn)的嵌合小鼠，對(duì)960 bp~30kb 的不同長度的3 個(gè)DNA 片段進(jìn)行了反轉(zhuǎn)，并且獲得了反轉(zhuǎn)事件的嵌合小鼠并實(shí)現(xiàn)DNA 片段反轉(zhuǎn)的種系傳代，成功獲得了F1 代反轉(zhuǎn)小鼠。DNA 片段靶向重復(fù)：在小鼠中能夠通過基因打靶和跨等位基因重組的方法獲得靶向DNA片段重復(fù)，但操作難度大，且效率偏低。Kraft等在小鼠ESCs 中，通過Cas9 kb~ Mb 之間的6 個(gè)不同位點(diǎn)進(jìn)行操作，在其中4 個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)到DNA重復(fù)事件的存在，然后將具有DNA 片段重復(fù)事件的克隆進(jìn)行培育以獲得嵌合體小鼠。盡管利用CRISPR/cas9 系統(tǒng)進(jìn)行DNA 片段靶向重復(fù)研究才剛剛起步，效率還有待提高。DNA 片段靶向插入：麻省理工學(xué)院張鋒團(tuán)隊(duì)在EMX1 位點(diǎn)利用Cas9 切口酶形成的DNA 切口或Cas9 形成的DNA雙鏈斷裂都可以有效地介導(dǎo)同源重組(HR)來插入包含兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)的DNA 片段。染色體靶向易位：染色體易位常常與腫瘤發(fā)生有著密不可分的關(guān)系，因此染色體易位的研究對(duì)于人們認(rèn)識(shí)腫瘤的發(fā)病機(jī)理尤為重要。例如，在慢性粒細(xì)胞白血病發(fā)生發(fā)展中， 染色體易位造成了費(fèi)城染色體形成，它能夠編碼BCRABL 融合蛋白產(chǎn)生白血病。在不同的染色體上引入同時(shí)出現(xiàn)的DSBs 是引發(fā)染色體易位必不可少的環(huán)節(jié)之一。利用ISce I 或鋅指核酸酶(ZFN)在染色體的特定位點(diǎn)引入DSBs 從而引發(fā)染色體易位。自CRISPR 技術(shù)出現(xiàn)以來，因其高效、便捷、易操作等特性，已有不少科研團(tuán)隊(duì)將其應(yīng)用于染色體易位的相關(guān)研究。CRISPRCas9 在抗病毒工程菌中應(yīng)用：Barrangou 等將嗜熱鏈球菌與不同的噬菌體共培養(yǎng)，篩選具有噬菌體抗性的菌株，通過DNA 測(cè)序發(fā)現(xiàn)CRISPR 座位中有了新的間隔序列，該間隔序列來自侵染的噬菌體，并且證實(shí)了CRISPR 和其相關(guān)的cas 基因賦予了細(xì)菌對(duì)噬菌體的抗性，通過插入或刪除靶向噬菌體的間隔序列可增強(qiáng)或者削弱細(xì)菌的噬菌體抗性?？傊珻RISPRCas9是細(xì)菌的一種“獲得性免疫系統(tǒng)”。2CRISPRCas9技術(shù)目前需解決的關(guān)鍵問題是克服其脫靶現(xiàn)象，請(qǐng)了解相關(guān)研究進(jìn)展并提出解決方案。 雖然普通質(zhì)粒很多時(shí)候也能達(dá)到實(shí)驗(yàn)效果，但是質(zhì)粒轉(zhuǎn)染具有效率低，作用時(shí)間短暫性等缺點(diǎn)。病毒的出現(xiàn)解決了質(zhì)粒這些問題，常用的病毒主要有慢病毒和腺病毒，慢病毒常用質(zhì)粒見addgene，慢病毒可以整合入宿主基因組中，長期穩(wěn)定的表達(dá)（漢恒生物提供CRISPR/cas9慢病毒包裝），但是由于慢病毒克隆能力有限而CAS9本身分子量比較大（大于4kb），且長期插入可能導(dǎo)致亂切，脫靶等，同時(shí)慢病毒包裝最終獲得的滴度不高等原因，腺病毒更有優(yōu)勢(shì)，腺病毒克隆能力強(qiáng)，獲得的病毒滴度也高。同時(shí)相對(duì)于普通質(zhì)粒來說，作用是時(shí)間也比較長，可以達(dá)到更理想的敲除效果。Cas9 存在一定的脫靶效應(yīng)：Ran 等在小鼠受精卵中通過4 個(gè)靶向sgRNAs 在Cas9 切口酶作用下實(shí)現(xiàn)DNA 片段的刪除，他們?cè)贒YRK1A 位點(diǎn)處成功地嘗試了500~6000 bp DNA 片段的刪除。這種方法需要設(shè)計(jì)多一倍的靶向sgRNAs，雖然會(huì)減少脫靶率，但是多個(gè)sgRNAs 也可能引起復(fù)雜的組合型DNA 片段編輯?？傊?，利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)DNA 片段的靶向刪除(圖1A)，盡管這一技術(shù)還有待進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)展。第6章 ：2為什么白色念珠菌是人體內(nèi)最成功的共生菌和致病菌？白色念珠菌 是如何適應(yīng)宿主環(huán)境的，它的獨(dú)特的生物學(xué)特征是如何進(jìn)化出來的？ 認(rèn)識(shí)白色念珠菌的生物學(xué)特征。獨(dú)特的生物學(xué)特征超強(qiáng)的宿主環(huán)境適應(yīng)能力：形態(tài)轉(zhuǎn)換有性生殖毒性因子生物被膜宿主微環(huán)境適應(yīng)念珠菌宿主互作藥物及耐藥基因組及基因組穩(wěn)定性。形態(tài)轉(zhuǎn)換：白色念珠菌形態(tài)多樣性，具有兩種典型的形態(tài)轉(zhuǎn)換系統(tǒng)即White和 Opaque。是由內(nèi)源基因與外源環(huán)境因素作用的平衡。WOR1是調(diào)控Whiteopaque轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵基因。而形態(tài)轉(zhuǎn)換和致病性密切相關(guān)，WOR1是正反饋調(diào)控，一旦被激活則高表達(dá)，從而促進(jìn)opaque表型的形成，形態(tài)轉(zhuǎn)換有利于侵染宿主。宿主微環(huán)境適應(yīng)：（(1)念珠菌為什么要進(jìn)行形態(tài)轉(zhuǎn)換？ (2)念珠菌為什么能進(jìn)行形態(tài)轉(zhuǎn)換 (尤其是共生或感染過程中) ？）宿主環(huán)境特征：復(fù)雜和易變 @相對(duì)高溫（37 186。C） @高濃度CO 2 @低濃度O 2 @變化的pH @變化的營養(yǎng)條件（金屬離子、 N和C源） @宿主黏膜物質(zhì) @免疫細(xì)胞釋放自由基、抗菌肽 ……白色念珠菌宿主環(huán)境應(yīng)答，宿主環(huán)境因子會(huì)對(duì)白色念珠菌進(jìn)行形態(tài)轉(zhuǎn)換的調(diào)控，調(diào)控因子有 CO 2 和 GlcNAc會(huì)促進(jìn)白念珠菌灰菌形成。CO2感應(yīng)研究將揭示白念珠菌宿主環(huán)境 適應(yīng)和感染的機(jī)制。有性生殖：Mating type locus 調(diào)控白 灰形態(tài)轉(zhuǎn)換。只有a/a 和alpha/alpha菌株 能進(jìn)行白 灰轉(zhuǎn)換；只有灰菌能進(jìn)行高效率交配。交配效率非常低，尤其在37℃，白灰形態(tài)轉(zhuǎn)換可以調(diào)控念珠菌有性生殖過程。White cells 可以促進(jìn) opaque cells交配。不同形態(tài)細(xì)胞通過信息素進(jìn)行細(xì)胞間交流，White細(xì)胞提高了整體信息素濃度從而促進(jìn)opaque cells交配。1. 限制有性生殖，white細(xì)胞中完全關(guān)閉交 配相關(guān)生物學(xué)過程。有利于營養(yǎng)繁殖或其他生 物學(xué)過程的完成。 ‘‘Cost of males’’ ；b. 有性繁殖慢于無 性繁殖； … 2. 2. 適當(dāng)時(shí)候，促進(jìn)有性生殖。 有利于遺傳重組，雜種優(yōu)勢(shì)、去除有害突變、增 加遺傳多樣性，…， 保持長期進(jìn)化中的優(yōu)勢(shì)。平衡了種群長期進(jìn)化與短期快速環(huán)境適應(yīng)的之間的矛盾 以最經(jīng)濟(jì)節(jié)約的方式達(dá)到目的。White cells 促進(jìn) opaque cells侵染組織。灰菌菌絲細(xì)胞能進(jìn)行高效率交配。菌絲生長：侵染人體組織。意義：（1）在兩種形態(tài)轉(zhuǎn)換系統(tǒng)之間建立了聯(lián)系；（2）暗示白念珠菌形態(tài)發(fā)生可能有更強(qiáng)的可塑性及宿主環(huán)境適應(yīng)能力。生物被膜：Biofilm：一種獨(dú)特的微環(huán)境。在特定的條件下，細(xì)菌可以形成生物被膜，包被有生物被膜的細(xì)菌稱為被膜菌。被膜菌無論其形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化特性、致病性還是對(duì)環(huán)境因子的敏感性等都與浮游細(xì)菌有顯著的不同，尤其對(duì)抗生素和宿主免疫系統(tǒng)具有很強(qiáng)的抵抗力，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床問題，引起許多慢性和難治性感染疾病的反復(fù)發(fā)作。成功致病菌的四個(gè)特征：（≥37176。C）； ； ； 。 有超強(qiáng)的適應(yīng)宿主微環(huán)境的能力！怎樣預(yù)防和治療白色念珠菌和其他真菌引起的疾病？l 通過認(rèn)識(shí)白色念珠菌的生物學(xué)特征，減少感染機(jī)會(huì)；有超強(qiáng)的適應(yīng)宿主微環(huán)境的能力：高溫環(huán)境適應(yīng)（≥37176。C）；能侵染人體組織；利用和吸收人體組織來源的養(yǎng)分；逃避和抵抗免疫系統(tǒng)的攻擊。獨(dú)特的生物學(xué)特征超強(qiáng)的宿主環(huán)境適應(yīng)能力：形態(tài)轉(zhuǎn)換、有性生殖、毒性因子、生物被膜、宿主微環(huán)境適應(yīng)、念珠菌宿主互作、藥物及耐藥、基因組及基因組穩(wěn)定性l 因此，我們可以不殺死真菌，而只是抑制其菌絲的生長來削弱其侵染人體的能力，同時(shí)能夠避免真菌產(chǎn)生抗藥性。l 因?yàn)?，真菌及其生物被膜無論其形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化特性、致病性還是對(duì)環(huán)境因子的敏感性等都與浮游細(xì)菌有顯著的不同，尤其對(duì)抗生素和宿主免疫系統(tǒng)具有很強(qiáng)的抵抗力，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床問題，引起許多慢性和難治性感染疾病的反復(fù)發(fā)作。因此我們可以抑制其形成生物被摸，從而講授真菌的抗藥性并且使其致病性被減弱或消除。l 尋找防治的靶標(biāo)基因：白色念珠菌可以通過形態(tài)轉(zhuǎn)換來逃避和抵抗免疫系統(tǒng)的攻擊，因此我們可以開發(fā)作用于對(duì)其形態(tài)轉(zhuǎn)換進(jìn)行調(diào)控的把標(biāo)記基因，比如：WOR1。白色念珠菌可以通過遮掩betaglycan來逃避和抵抗免疫系統(tǒng)的攻擊，使暴露betaglycan即可激活免疫反應(yīng)，從而治療真菌疾病。l 微生物生存法則：1. 主要以G0期存在；。我們可以利用這項(xiàng)法則來治療和預(yù)防真菌疾病。GlcNAc（營養(yǎng)信號(hào)分子）誘導(dǎo)白念珠菌細(xì)胞死亡，因?yàn)镚lcNAc處理的細(xì)胞不能進(jìn)入G0期。Mac1也可以調(diào)控白念珠菌細(xì)胞死亡。3學(xué)習(xí)微生物遺傳與分子生物學(xué)這門課程有何感想？ 在學(xué)習(xí)完這門微生物遺傳以分子生物學(xué)這門課程后，我對(duì)這門課程所講到的微生物的遺傳以及其分子操作有了比較詳盡與直觀的理解。 首先，鏈霉菌方面，譚老師和劉老師的研究部分是鏈霉菌（放線菌）的遺傳特性以及次生代謝的分子調(diào)控以及其遺傳基礎(chǔ)與操作知識(shí)。通過老師詳盡的講解，我對(duì)于鏈霉菌的生理分化過程有了非常深刻的印象，并且通過其次生代謝部分，學(xué)習(xí)了其抗生素的產(chǎn)分子生調(diào)控機(jī)制，尤其是群體感應(yīng)信號(hào)分子介導(dǎo)的抗生素合成的分子機(jī)制。并且，通過本課程的學(xué)習(xí)，我們可以運(yùn)用老師所教授的分子生物學(xué)技術(shù)來進(jìn)行我以后課題的研究。這將有助于我拓展我們的思路。 大腸桿菌,芽孢桿菌,乳酸菌方面，鐘老師為我們講授了模式生物的遺傳與分子生物學(xué)技術(shù)。重點(diǎn)介紹各類細(xì)菌突出的分子遺傳特點(diǎn)和最新研究進(jìn)展，同時(shí)也講述各類細(xì)菌在工農(nóng)業(yè)及食品保健等領(lǐng)域的應(yīng)用，使我們對(duì)細(xì)菌分子遺傳研究有了較全面認(rèn)識(shí)。 這部分內(nèi)容我覺得對(duì)我?guī)椭畲蟮膽?yīng)該是大腸桿菌，它是一種生物技術(shù)載體，幾乎每個(gè)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室都在使用的一種細(xì)菌，包括我們實(shí)驗(yàn)室。學(xué)習(xí)它的遺傳與操作技術(shù)，確實(shí)增加了我對(duì)于基礎(chǔ)的技術(shù)了解。 古菌方面，向老師為我們講授了古菌，它有一個(gè)原核的外表，卻有著一個(gè)真核的內(nèi)心，這句話涵蓋了古菌的基本遺傳特征。講授方式更加簡單易懂。老師講授的CRISPR技術(shù)也是目前計(jì)較熱的基因組編輯技術(shù)，是我們對(duì)這項(xiàng)技術(shù)有個(gè)比較詳盡的了解。 真菌部分，黃老師為我們?cè)敱M的講授了真菌生物，主要是講授了白色念珠菌的研究。并且為我們提供了一些預(yù)防和治療真菌的可能的途徑，有待于我們來思考。 最后，老師請(qǐng)了研究這些微生物的專家來講授不同的部分，這讓我們對(duì)于這些微生物的遺傳以及分子操作技術(shù)有了更加