【正文】 所有細胞生命都有核糖體RNA, 便于對整個生命體系進行進化關(guān)系分析，之前任何已知蛋白都達不到此標準； 核糖體RNA含量極高(80%)，易于制備（密度梯度離心或膠回收）； 其進化具有良好的時鐘性質(zhì)，在結(jié)構(gòu)與功能上具有高度的保守性，即使進化關(guān)系較遠的物種間也可進行相關(guān)性比較； 當時相當一部分生物或細胞器中的16S (18S) 的rRNA 序列已經(jīng)被鑒定；RNA片段測序已可行 16S (18S) 的rRNA 大小適中()，適于用于進化關(guān)系分析, 而5S() rRNA過??；23S (28S) rRNA過大。l 蛋白組：嗜熱菌蛋白結(jié)構(gòu)中的特殊的疏水作用、離子對以及鹽橋也可起到穩(wěn)定作用。2 新近在火星上發(fā)現(xiàn)了液態(tài)水存在的證據(jù)，暗示可能有極端微生物存在。相比之下，℃左右。l 嗜鹽古菌對飽和鹽濃度，輻射等的極端適應能力，具體地外（如火星）生命的可能特質(zhì)。而目前火星上發(fā)現(xiàn)了液態(tài)水，并且有較強輻射，因此也可能是存在于火星的極端微生物?；鹦悄壳暗拇髿馀c數(shù)十億年前地球的大氣有著驚人的相似之處。大氣層完全由二氧化碳和氮構(gòu)成。同樣，現(xiàn)在火星上薄薄的大氣層幾乎完全由二氧化碳構(gòu)成。l 科學家在格陵蘭島地下冰芯中發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)甲烷古菌生存的證據(jù)。產(chǎn)甲烷古菌是一種極其古老的微生物，比細菌還要原始。根據(jù)地球的經(jīng)驗，只要有液態(tài)水并且有一定的熱量，幾乎肯定可以有生命存活，因此推測，火星的液態(tài)水中很有可能含有甲烷古菌。如生活于鹽湖或曬鹽場的極端嗜鹽古菌，生活于海底熱液口的極端嗜熱古菌，以及生活于硫磺熱泉的嗜酸熱古菌?！坝職狻碧柟矙z查了6種巖石，從這些巖石構(gòu)成可推測，歷史上“赫斯本德山”附近區(qū)域氣候非常炎熱而狂暴，經(jīng)常有火山噴發(fā)和天體撞擊，而水可能只一度存在于熱泉中，或以極微量存在于巖層中?？茖W家發(fā)現(xiàn)在火星表面的一些隕坑的坑壁上存在一些暗色條帶，被稱作“季節(jié)性斜坡條帶”（RSL），這些暗色條帶會季節(jié)性地出現(xiàn)在一些坡度較為陡峭且相對溫暖的火星隕坑向陽坡面上。CRISM設備的數(shù)據(jù)顯示，這些所謂的“季節(jié)性斜坡條帶”(RSL)被一層鹽類所覆蓋。這些鹽類溶入水體后可以使液態(tài)水的冰點降低達80攝氏度，并使其蒸發(fā)效率減低10倍以上。2 古菌啟動子、基礎轉(zhuǎn)錄因子、RNA聚合酶及調(diào)控因子有什么特色？古菌為環(huán)狀染色體，經(jīng)常有大小染色體且通常具有多個復制起點。古菌的特殊性在于其基礎轉(zhuǎn)錄機器與真核生物高度同源（EA型），而其調(diào)控因子更類似于細菌（BA型）。l 首先由基礎轉(zhuǎn)錄因子TBP識別TATA box (AT rich,25~30) (中溫古菌中，其TBP甚至可被真菌或人的TBP替換）；接著上述復合物被另一種基礎轉(zhuǎn)錄因TFB結(jié)合于BRE區(qū)（位于TATA box上游），從而確定轉(zhuǎn)錄方向并通過招募RNA聚合酶起始轉(zhuǎn)錄；RNA聚合酶覆蓋從TATAbox到+18的區(qū)域，解鏈并從+1開始轉(zhuǎn)錄；其它轉(zhuǎn)錄因子如TFE也參與某些基因的轉(zhuǎn)錄（可能對RNAP招募及DNA解鏈有促進作用）。Lrs14阻止轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合；MDR1阻止RNAP結(jié)合。奇特之處：是特定的GTF, 而不是其它調(diào)控蛋白調(diào)控了該熱誘導基因的表達。2 如果要人工合成1個單細胞生命的基因組，在基因組有效復制及分配等方面需要考慮哪些因素。終止：由RNA酶H降解RNA引物并由DNA聚合酶 I 將缺口補齊，再由DNA連接酶將每兩個岡崎片段連在一起形成大分子DNA。就是說，現(xiàn)擴增出目的基因的上下游同源臂，構(gòu)建出一個質(zhì)粒敲除載體，然后將質(zhì)粒載體導入到野生型細胞中，誘導其發(fā)生同源重組，進行一次交換，隨后進行雙交換，從而成功的敲除目的基因，獲得突變株。若敲除該基因后，其編碼物質(zhì)不能合成，并且嚴重影響到突變株的生命活動以及代謝，那么該基因是必不可少的。Eg. 解析尋找嗜鹽古菌PHBV合成關(guān)鍵酶：β酮硫解酶PhaA/BktB 。 通過組合基因敲除互補發(fā)現(xiàn)PHBV特異的β酮硫解酶 。 2 試述說明甲烷古菌、嗜鹽古菌、高溫古菌的特色及研究意義。 極端古菌的極端適應性和獨特代謝能力為生命機制及生物技術(shù)提供了新的途徑和策略。 l 甲烷古菌：厭氧培養(yǎng)，遺傳轉(zhuǎn)化相對較困難，胞內(nèi)環(huán)境中性，可借用細菌一些基因元件，但復制子及抗生素選擇標記等不同于細菌。 研究意義：甲烷古菌的研究意義：a. 甲烷是重要的可再生能源： 天然氣:人類利用甲烷燃氣有3000多年的歷史； “西氣東輸工程” 沼氣發(fā)酵：有機廢物資源化的可再生能源, 甲烷為分解代謝的末端產(chǎn)物。 1940年Barker分離到第一個甲烷菌； 1976年分析甲烷菌的SSU rRNA、發(fā)現(xiàn)細胞膜含醚鍵酯：Carl Woese提出第三生命域古菌理論的基礎； 1970s，發(fā)現(xiàn)甲烷菌的獨特的酶和輔酶：甲基CoM還原酶，F(xiàn)420, F430, CoM,甲烷呋喃，四氫甲烷喋呤；及特殊的金屬離子：鈷、鎢、鎳、錳； 1996年第一個古菌基因組甲烷古菌，確立第三生命域； 2000s發(fā)現(xiàn)甲烷古菌利用低限能量生長、利用22種氨基酸合成蛋白質(zhì)……嗜鹽古菌的研究特色和意義 1) 嗜鹽古菌作為古菌生物學研究的重要材料，一個突出的優(yōu)勢在于相對最容易培養(yǎng)，生長較快，不容易污染和被污染，且具豐富的遺傳與代謝多樣性，并具有古菌域中最完善的遺傳操作系統(tǒng)。如死海鹽合菌（Haloarcula marismortui)核糖體的解析，催生了2009年諾貝爾化學獎；而嗜鹽古菌膜蛋白的研究，不僅代表著跨膜蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究的最高水平，還正在促進一系列光化學技術(shù)的應用；嗜鹽古菌PHA的研究則為生物塑料的生產(chǎn)提供了新的策略。 4) 嗜鹽古菌對飽和鹽濃度，輻射等的極端適應能力，具體地外（如火星）生命的可能特質(zhì)，因此也是研究地外生命起源，傳播的重要材料。 2 理解引發(fā)適應在CRISPR系統(tǒng)對抗病毒逃逸方面的重要意義和機制。每個新的spacer加入后， CRISPRrepeat序列就會加倍。具體細節(jié)尚待進一步研究。Cas3通過一個使Cas3核酸酶的活性減弱的機制加載到DNA的兩個可能的方向。第二步 crRNA合成加工 第三步 干擾（外源DNA特異降解）Type I () Cmr25與crRNA形成復合物。引發(fā)適應研究的重要意義：適應需要某一匹配病毒DNA 的spacer 。因此CRISPRCas系統(tǒng)對抗病毒逃逸方面有重要作用與意義。l 同時也解釋了實驗室觀察到的極個別高效適應（通過引發(fā)可將適應機器高效導向外源DNA）和在自然環(huán)境中的可能需要的廣泛的適應性（引發(fā)spacer無需嚴格匹配，可導向一大類同源病毒，并可通過次生spacer級聯(lián)放大至更多其它病毒)。 干擾與適應的異己識別工作的意義：l 建立并統(tǒng)一了CRISPR適應與干擾過程的異己識別模型。 l 利用該機制，宿主菌貯存一定數(shù)量的spacer, 即可通過級聯(lián)識別環(huán)境中病毒的同源序列，迅速適應環(huán)境中的其它病毒。 2 CRISPR在現(xiàn)代微生物技術(shù)中的應用（菌株鑒定及溯源；抗病毒工程菌，基因組及合成生物學技術(shù)等等） （（ CRISPR/Cas是最近幾年出現(xiàn)的一種由RNA指導Cas核酸酶對靶向基因進行特定DNA修飾的技術(shù)。此系統(tǒng)的工作原理是crRNA通過堿基配對與tracrRNA結(jié)合形成tracrRNA/crRNA 復合物，此復合物引導核酸酶 Cas9 蛋白在與 crRNA 配對的序列靶位點處剪切雙鏈 DNA，從而實現(xiàn)對基因組DNA序列進行編輯；而通過人工設計這兩種 RNA，可以改造形成具有引導作用的gRNA (guide RNA)，足以引導 Cas9 對 DNA 的定點切割。））） l CRISPRCas9技術(shù)的應用：Ⅱ型CRISPR/Cas9 系統(tǒng)自出現(xiàn)以來，得到迅速而廣泛的應用，是生物學研究歷史上類似PCR 一樣重要的技術(shù)變革。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在基因組DNA 片段編輯中的應用：Ⅱ型CRISPR/Cas 系統(tǒng)只需要一個Cas9 蛋白核酸酶來切割DNA 雙鏈,即為現(xiàn)在廣泛應用于遺傳學基因編輯的CRISPR/Cas9 系統(tǒng)。DNA 片段靶向刪除：研究基因和調(diào)控元件的功能，可以通過刪除這一段DNA 片段來進行探索。張鋒團隊在EMX1 位點設計的相距119 bp 的兩個靶向sgRNAs 對該119 bp DNA 片段進行了刪除。他們在哺乳動物細胞中對709 bp~1 Mb 的7 個不同長度的DNA 片段進行了有效地反轉(zhuǎn)(圖1B)；同時他們將Cas9 mRNA 和兩個靶向sgRNAs 注射到小鼠受精卵中，再將被注射后存活的受精卵移植到假孕鼠中獲得后代，篩選得到了反轉(zhuǎn)的嵌合小鼠，對960 bp~30kb 的不同長度的3 個DNA 片段進行了反轉(zhuǎn)，并且獲得了反轉(zhuǎn)事件的嵌合小鼠并實現(xiàn)DNA 片段反轉(zhuǎn)的種系傳代，成功獲得了F1 代反轉(zhuǎn)小鼠。Kraft等在小鼠ESCs 中，通過Cas9 kb~ Mb 之間的6 個不同位點進行操作，在其中4 個位點檢測到DNA重復事件的存在，然后將具有DNA 片段重復事件的克隆進行培育以獲得嵌合體小鼠。DNA 片段靶向插入：麻省理工學院張鋒團隊在EMX1 位點利用Cas9 切口酶形成的DNA 切口或Cas9 形成的DNA雙鏈斷裂都可以有效地介導同源重組(HR)來插入包含兩個限制性酶切位點的DNA 片段。例如，在慢性粒細胞白血病發(fā)生發(fā)展中， 染色體易位造成了費城染色體形成，它能夠編碼BCRABL 融合蛋白產(chǎn)生白血病。利用ISce I 或鋅指核酸酶(ZFN)在染色體的特定位點引入DSBs 從而引發(fā)染色體易位。CRISPRCas9 在抗病毒工程菌中應用：Barrangou 等將嗜熱鏈球菌與不同的噬菌體共培養(yǎng)，篩選具有噬菌體抗性的菌株，通過DNA 測序發(fā)現(xiàn)CRISPR 座位中有了新的間隔序列，該間隔序列來自侵染的噬菌體，并且證實了CRISPR 和其相關(guān)的cas 基因賦予了細菌對噬菌體的抗性，通過插入或刪除靶向噬菌體的間隔序列可增強或者削弱細菌的噬菌體抗性。2CRISPRCas9技術(shù)目前需解決的關(guān)鍵問題是克服其脫靶現(xiàn)象，請了解相關(guān)研究進展并提出解決方案。病毒的出現(xiàn)解決了質(zhì)粒這些問題，常用的病毒主要有慢病毒和腺病毒，慢病毒常用質(zhì)粒見addgene，慢病毒可以整合入宿主基因組中，長期穩(wěn)定的表達（漢恒生物提供CRISPR/cas9慢病毒包裝），但是由于慢病毒克隆能力有限而CAS9本身分子量比較大（大于4kb），且長期插入可能導致亂切，脫靶等，同時慢病毒包裝最終獲得的滴度不高等原因，腺病毒更有優(yōu)勢，腺病毒克隆能力強，獲得的病毒滴度也高。Cas9 存在一定的脫靶效應：Ran 等在小鼠受精卵中通過4 個靶向sgRNAs 在Cas9 切口酶作用下實現(xiàn)DNA 片段的刪除，他們在DYRK1A 位點處成功地嘗試了500~6000 bp DNA 片段的刪除?？傊肅RISPR/Cas9 系統(tǒng)可以實現(xiàn)DNA 片段的靶向刪除(圖1A)，盡管這一技術(shù)還有待進一步優(yōu)化發(fā)展。獨特的生物學特征超強的宿主環(huán)境適應能力：形態(tài)轉(zhuǎn)換有性生殖毒性因子生物被膜宿主微環(huán)境適應念珠菌宿主互作藥物及耐藥基因組及基因組穩(wěn)定性。是由內(nèi)源基因與外源環(huán)境因素作用的平衡。而形態(tài)轉(zhuǎn)換和致病性密切相關(guān)，WOR1是正反饋調(diào)控，一旦被激活則高表達，從而促進opaque表型的形成，形態(tài)轉(zhuǎn)換有利于侵染宿主。C） 高濃度CO 2 低濃度O 2 變化的pH 變化的營養(yǎng)條件（金屬離子、 N和C源） 宿主黏膜物質(zhì) 免疫細胞釋放自由基、抗菌肽 ……白色念珠菌宿主環(huán)境應答，宿主環(huán)境因子會對白色念珠菌進行形態(tài)轉(zhuǎn)換的調(diào)控，調(diào)控因子有 CO 2 和 GlcNAc會促進白念珠菌灰菌形成。有性生殖：Mating type locus 調(diào)控白 灰形態(tài)轉(zhuǎn)換。交配效率非常低，尤其在37℃，白灰形態(tài)轉(zhuǎn)換可以調(diào)控念珠菌有性生殖過程。不同形態(tài)細胞通過信息素進行細胞間交流，White細胞提高了整體信息素濃度從而促進opaque cells交配。有利于營養(yǎng)繁殖或其他生 物學過程的完成。 有利于遺傳重組，雜種優(yōu)勢、去除有害突變、增 加遺傳多樣性，…， 保持長期進化中的優(yōu)勢。White cells 促進 opaque cells侵染組織。菌絲生長：侵染人體組織。生物被膜：Biofilm：一種獨特的微環(huán)境。被膜菌無論其形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化特性、致病性還是對環(huán)境因子的敏感性等都與浮游細菌有顯著的不同，尤其對抗生素和宿主免疫系統(tǒng)具有很強的抵抗力，從而導致嚴重的臨床問題，引起許多慢性和難治性感染疾病的反復發(fā)作。C）； ； ； 。C）；能侵染人體組織；利用和吸收人體組織來源的養(yǎng)分；逃避和抵抗免疫系統(tǒng)的攻擊。l 因為，真菌及其生物被膜無論其形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化特性、致病性還是對環(huán)境因子的敏感性等都與浮游細菌有顯著的不同，尤其對抗生素和宿主免疫系統(tǒng)具有很強的抵抗力，從而導致嚴重的臨床問題，引起許多慢性和難治性感染疾病的反復發(fā)作。l 尋找防治的靶標基因：白色念珠菌可以通過形態(tài)轉(zhuǎn)換來逃避和抵抗免疫系統(tǒng)的攻擊，因此我們可以開發(fā)作用于對其形態(tài)轉(zhuǎn)換進行調(diào)控的把標記基因，比如：WOR1。l 微生物生存法則：1. 主要以G0期存在；。GlcNAc（營養(yǎng)信號分子）誘導白念珠菌細胞死亡，因為GlcNAc處理的細胞不能進入G0期。3學習微生物遺傳與分子生物學這門課程有何感想？ 在學習完這門微生物遺傳以分子生物學這門課程后，我對這門課程所講到的微生物的遺傳以及其分子操作有了比較詳盡與直觀的理解。通過老師詳盡的講解，我對于鏈霉菌的生理分化過程有了非常深刻的印象，并且通過其次生代謝部分，學習了其抗生素的產(chǎn)分子生調(diào)控機制，尤其是群體感應信號分子介導的抗生素合成的分子機制。這將有助于我拓展我們的思路。重點介紹各類細菌突出的分子遺傳特點和最新研究進展，同時也講述各類細菌在工農(nóng)業(yè)及食品保健等領(lǐng)域的應用，使我們對細菌分子遺傳研究有了較全面認識。學習它的遺傳與操作技術(shù)，確實增加了我對于基礎的技術(shù)了解。講授方式更加簡單易懂。 真菌部分，黃老師為我們詳盡的講授了真菌生物，主要是講授了白色念珠菌的研究。 最后，老師請了研究這些微生物的專家來講授不同的部分，這讓我們對于這些微生物的遺傳以及分子操作技術(shù)有了