【正文】 ），本例中PhaR通過(guò)感應(yīng)PHA顆粒上的空間而調(diào)節(jié)對(duì)phaRP啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合，從而同時(shí)調(diào)節(jié)PHA顆粒關(guān)鍵蛋白PhaP和自身的表達(dá)，確保了PHA顆粒的有序形成；因此在地中海富鹽菌中，PhaR在其PHA積累和顆粒形成中起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。l 調(diào)控因子：轉(zhuǎn)錄調(diào)控主要發(fā)生在起始位點(diǎn)和起始階段:任何步驟被阻止都可抑制基因表達(dá)；任何步驟被強(qiáng)化都可能增強(qiáng)基因表達(dá)。真核型復(fù)制機(jī)器比古菌更復(fù)雜，主要原因是有更多生理過(guò)程需要協(xié)調(diào)，其核心蛋白與古菌同源，與細(xì)菌不同。這些鹽類的主要成分是高氯酸鎂、氯酸鈉和一些氯化物。因此可能會(huì)存在熱泉，所以推測(cè)火星上可能會(huì)有極端嗜熱古菌和嗜熱酸古菌存在。l 在地球各種極端自然環(huán)境中生活的古菌，又稱為極端古菌。這種能在極端嚴(yán)酷條件下生存的微生物有可能在火星上生存。直到地球上進(jìn)化出了光合細(xì)菌，才產(chǎn)生了足夠的氧氣，從而進(jìn)化出動(dòng)物。l 火星大氣層構(gòu)成：%的二氧化碳、%的氮、%的氬、%的氧。 而溫度極限兩級(jí)極有可能是古菌存在。l 基因組：高G+C (6070% ), 結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定； 多復(fù)制子及多復(fù)制起始位點(diǎn)，基因組復(fù)制穩(wěn)定性 ；每個(gè)復(fù)制子多拷貝，生理調(diào)節(jié)及抗損傷的適應(yīng)性 ；l 特殊代謝途以上的分子生物學(xué)特性使得極端嗜熱古菌成為地球上最耐熱的生命形式。該技術(shù)主要有三個(gè)步驟：首先是基因組DNA的獲得，其次是16S rRNA基因片段的獲得，最后是進(jìn)行16S rRNA基因序列的分析。16S rRNA基因是細(xì)菌上編碼rRNA相對(duì)應(yīng)的DNA序列，存在于所有細(xì)菌的基因組中。16S rRNA的339。細(xì)菌的16S rRNA含有1540個(gè)核苷酸，相對(duì)分子質(zhì)量適中，很適合研究菌株分類進(jìn)化。羊毛硫細(xì)菌素的生物合成基因簇的組成：參與羊毛硫細(xì)菌素合成的基因一般位于一個(gè)基因簇中，簇中基因一般包括羊毛硫細(xì)菌素結(jié)構(gòu)基因，修飾基因，轉(zhuǎn)運(yùn)加工蛋白基因、免疫蛋白基因及調(diào)控蛋白基因。l 基因組中都含有假基因 ：所有的乳酸菌都含有假基因且數(shù)目變化很大，如在腸膜明串珠菌中20個(gè)，嗜熱鏈球菌含有200個(gè)假基因。對(duì)于已有的成熟MLST方案的細(xì)菌，可直接從MLST數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取分型方案。多位點(diǎn)序列分型技術(shù)（MLST）： 是一種基于核酸序列測(cè)定的細(xì)菌分型方法，通過(guò)PCR擴(kuò)增6~10個(gè)管家基因內(nèi)部400~600bp核苷酸序列，測(cè)定其序列，分析菌株的變異，從而進(jìn)行分型。l 谷氨酸棒桿菌對(duì)冷的應(yīng)答 l 谷氨酸棒桿菌對(duì)酸的應(yīng)答 ：在中性或低pH時(shí)，谷氨酸棒桿菌會(huì)因氧化脅迫而受損，氧化脅迫的存在會(huì)干擾鐵離子的活性，調(diào)控谷氨酸棒桿菌的代謝。MtrAB系統(tǒng)作用：調(diào)控細(xì)胞壁的合成以及維持高滲環(huán)境下細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡。參與調(diào)控： 芳香化合物的降解 ；有氧及無(wú)氧呼吸 ；糖的吸收、酵解及再生 ；谷氨酸鹽的吸收及氮的同化 ；醋酸鹽、乳酸鹽、葡萄糖酸鹽、乙醇代謝 ；脂肪酸和脫氧核糖核酸的合成 ；細(xì)胞的壓力應(yīng)答及復(fù)蘇 。）轉(zhuǎn)錄組信息：l 調(diào)控蛋白（ regulators）：C. glutamicum：158個(gè)調(diào)控蛋白（ 128個(gè)DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子, 13個(gè)TCS應(yīng)答蛋白，10個(gè)其它調(diào)控蛋白以及7個(gè)σ因子），% 。b. 雙基因敲除 ：dtsR1 和 pyc的敲除抑制菌體生長(zhǎng)，但可使菌體在無(wú)誘導(dǎo)劑的條件下產(chǎn)L谷氨酸 ；加入生物素，% ；加入吐溫40，% 吐溫40可通過(guò)抑制DstR活性使脂肪酸合成降低，進(jìn)而提高谷氨酸產(chǎn)量。 (3) 泡沫過(guò)多,易沖上罐頂,造成染菌。 l pH值 ：pH值影響谷氨酸產(chǎn)生菌的生長(zhǎng) pH：前期pH（）。l 發(fā)酵溫度 ：谷氨酸發(fā)酵前期應(yīng)采取菌體生長(zhǎng)最適溫度,即30～32 ℃。l 發(fā)酵液的碳氮比 ：發(fā)酵液中糖含量與谷氨酸的發(fā)酵有密切的關(guān)系。供氧不足：積累大量的乳酸，使發(fā)酵液的pH值下降，不利于谷氨酸的產(chǎn)生，同時(shí)，一部分葡萄糖轉(zhuǎn)成了乳酸，影響了糖酸轉(zhuǎn)化率，降低了產(chǎn)物的提出率。 l 菌體有強(qiáng)烈的L谷氨酸脫氫酶活性： L谷氨酸脫氫酶，谷氨酸產(chǎn)生菌體內(nèi)該酶的酶活性都很強(qiáng)， α 酮戊二酸易生成谷氨酸。 l αKGA（ α酮戊二酸）脫氫酶酶活性微弱或喪失：這是菌體生成并積累αKGA的關(guān)鍵。最終使害蟲無(wú)法存活，達(dá)到殺蟲的目的。1 Bt菌株在孢子形成期及營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期分別形成哪些不同的殺蟲毒素，簡(jiǎn)述Cry蛋白殺蟲機(jī)制。l ATPbinding cassette (ABC) transporters: 在真核、原核生物中發(fā)現(xiàn)，既可輸出也可輸入各種分子，如離子、氨基酸、肽、抗生素、多糖及蛋白質(zhì)等。②Tat 途徑的蛋白分泌過(guò)程：216。③蛋白的折疊及釋放：在易位過(guò)程中或易位之后的瞬間，信號(hào)肽被type I Spases切除，使成熟肽從Sec易位酶復(fù)合物上釋放；最后，胞外分子伴侶參與分泌蛋白的折疊及質(zhì)量控制。1 B. subtilis分泌蛋白有哪4種不同途徑，簡(jiǎn)述每種途徑分泌蛋白過(guò)程及所分泌蛋白特點(diǎn)。Nisin是食品級(jí)的安全誘導(dǎo)物，可直接應(yīng)用的食品中；少量nisin即可誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)。：這種方式大大加快了納豆激酶的生產(chǎn)效率。通過(guò)枯草芽孢桿菌培養(yǎng)，利用(NH4)2SO4沉淀、Sephadex G100柱層析對(duì)該酶發(fā)酵液進(jìn)行分離純化，已經(jīng)分離純化出了枯草芽孢桿菌溶栓酶。 4　 ComK激活下游基因：當(dāng)ComK濃度足夠高，ComK可激活DNA攝取基因（C,E,G,F)、DNA整合基因（recA，addAB）及自身基因k的表達(dá)。1　 ComK的自激活循環(huán)ComK的自激活循環(huán)是形成感受態(tài)的關(guān)鍵步驟，ComK以二聚體組成的四聚物形式結(jié)合于各啟動(dòng)子上，激活下游基因轉(zhuǎn)錄，包括自身基因。通過(guò)對(duì)環(huán)境的感知，芽孢桿菌種控制孢子形成的雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中磷酸化的應(yīng)答調(diào)控蛋白（RR）轉(zhuǎn)錄調(diào)控子Spo0A可以激活SinI基因表達(dá)，從而產(chǎn)生抗阻遏蛋白SinI，通過(guò)與SinR的結(jié)合來(lái)降低SinR濃度，從而使細(xì)胞喪失運(yùn)動(dòng)性而形成細(xì)胞鏈并產(chǎn)生基質(zhì)，刺激感受態(tài)形成，最終促進(jìn)生物膜的形成。 在芽孢桿菌生物膜形成過(guò)程中，最主要的抑制子是什么？簡(jiǎn)述其是如何被解除并促進(jìn)生物膜的形成的。 c. B. cereus group中的質(zhì)粒：1) 是非常重要的形態(tài)因子，如B. thuringiensis的晶體毒蛋白基因與B. anthracis的炭疽毒素基因均位于質(zhì)粒元件上。Bacillus cereus group種間聯(lián)系與區(qū)分： 雖然Bacillus cereus group種間染色體具有很高的相似性和共線性，但是其包含幾百個(gè)菌株，也顯示了很高的基因異質(zhì)性及菌株特異的基因組適應(yīng)性，比如有些蠟狀芽胞桿菌具有跟炭疽芽胞桿菌類似的特征，包括其致病性，但是并不含有與后者完全一樣的質(zhì)粒。l 生物大分子的合成都需要酶，都需要溫和的反應(yīng)條件。從化學(xué)結(jié)構(gòu)而言，蛋白質(zhì)是由αL氨基酸脫水縮合而成的；核酸是由嘌呤和嘧啶堿基與糖D核糖或2脫氧D核糖、磷酸脫水縮合而成；多糖是由單糖脫水縮合而成。 耐熱型：免疫原性弱，100℃, 20 min不破壞； 不耐熱型：免疫原性強(qiáng)， 65℃, 30 min破壞； 類脂A：內(nèi)毒素，熱穩(wěn)定（ 100℃, 1 h不破壞）。部分通過(guò)獲得毒素因子適應(yīng)新環(huán)境或?qū)е录膊　亩梢院Y選其他可以與轉(zhuǎn)肽酶結(jié)合的藥物來(lái)開發(fā)新藥物。例如，篩選能夠結(jié)合抑制子RamR的小分子（藥物），使其對(duì)激活子RamA的抑制作用加強(qiáng)，從而降低外排泵的表達(dá)而降低細(xì)菌的抗性。綜合改造后生物大分子的產(chǎn)量提高了100多倍。C、輔因子工程：降低細(xì)胞內(nèi)的能量水平能顯著提高酵解速度。天然的大腸桿菌的MEP途徑可合成其中2個(gè)前體異戊烯焦磷酸（IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）。我們可以改進(jìn)大腸桿菌的分泌系統(tǒng)，從而加速其產(chǎn)生的生物大分子蛋白質(zhì)排除體外的效率。7. 其他新方法和策略未來(lái)可能的突破：以鏈霉菌為模式，進(jìn)一步闡明抗生素生物合成與調(diào)控機(jī)制，為提高重要抗生素的產(chǎn)量乃至激活隱基因簇，挖掘新型活性次級(jí)代謝產(chǎn)物方面做出創(chuàng)新性的研究成果 ；深入開展抗生素的組合生物合成和合成生物學(xué)的研究，突破天然產(chǎn)物合成過(guò)程中的瓶頸，獲得在結(jié)構(gòu)和功能上具有突出特點(diǎn)的新型活性化合物。5. 信號(hào)分子介導(dǎo)的激活：γ丁酸內(nèi)酯（GBL）作為放線菌的信號(hào)分子，通過(guò)與相應(yīng)的受體蛋白相互作用，進(jìn)而激活多種次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成。同時(shí)，相關(guān)菌株的共同培養(yǎng)可以提供互補(bǔ)的重要物質(zhì)和信息交流，這為隱性次級(jí)代謝基因簇的激活提供了可能的條件。每個(gè)基因組平均含有2030個(gè)左右次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇，大多數(shù)是未知的，這將是發(fā)現(xiàn)新型抗生素的龐大資源。當(dāng)A因子（GBL）積累到閾值時(shí)，它與ArpA結(jié)合，使ArpA從adpA上解離，導(dǎo)致adpA有效地進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。目前研究得最多的群體感應(yīng)系統(tǒng)有以下四種：革蘭氏陰性菌中的?；呓z氨酸內(nèi)酯(AHL)介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)、革蘭氏陽(yáng)性菌中的自誘導(dǎo)肽(AIP)介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)、呋喃硼酸二酯結(jié)構(gòu)的AI2介導(dǎo)的種間群體感應(yīng)系統(tǒng)和γ丁酸內(nèi)酯(GBL)介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)。前饋調(diào)控：指一種微生物代謝反應(yīng)的底物或中間物在代謝合成過(guò)程中對(duì)合成基因簇中調(diào)控基因或生化反應(yīng)關(guān)鍵酶基因的調(diào)控。全局調(diào)控基因可以調(diào)控多條次級(jí)代謝途徑。1. 抗生素生物合成的途徑特異性調(diào)控：鏈霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因簇通常成簇排列，包括一個(gè)或多個(gè)調(diào)控基因，一般只負(fù)責(zé)調(diào)控所在基因簇基因表達(dá)的調(diào)控稱之為途徑特異性調(diào)控。這些次級(jí)代謝產(chǎn)物在極低的濃度下，可以在生化水平調(diào)控微生物的生長(zhǎng)過(guò)程對(duì)菌體的生長(zhǎng)也具有重要的生物學(xué)意義。 抗生素是逐步合成的代謝產(chǎn)物, 每一步都需要約10 一30 個(gè)基因來(lái)決定其結(jié)構(gòu)和起自我保護(hù)作用抗性基因, 以及控制結(jié)構(gòu)基因活性的調(diào)控基因, 并使它們隨特性生存需要給予表達(dá)。鏈霉菌發(fā)育分化和次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成一般都是起始于對(duì)環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)匱乏的感應(yīng)。 對(duì)其自身的意義：營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，基質(zhì)菌絲經(jīng)過(guò)頂端生長(zhǎng)和分支，在感受到環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)限制或者其他壓力后，以應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫，鏈霉菌通過(guò)bld基因級(jí)聯(lián)信號(hào)通路產(chǎn)生疏水分子SapB，從而賦予菌絲表面疏水特性而使其突破培養(yǎng)基表面的氣水張力進(jìn)入繁殖性的氣生菌絲階段，然后又通過(guò)whi基因等的級(jí)聯(lián)信號(hào)通路控制下產(chǎn)生孢子，孢子成熟后飄落到適宜的環(huán)境中在進(jìn)行上述過(guò)程生活。比如應(yīng)用CRISPRCas9介導(dǎo)的同源重組基因編輯技術(shù)來(lái)使之直接發(fā)生雙交換而直接敲除靶標(biāo)基因，這樣操作起來(lái)并不繁瑣，也省去了些過(guò)程，并且對(duì)是否發(fā)生雙交換也比較好判斷。通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)移將含有FBT1整合酶的pIJ10500導(dǎo)入SattB6P6中，利用整合酶將目的基因簇環(huán)出，并克隆到載體pKC1139上。（CRISPR/Cas9系統(tǒng)先切斷靶序列后直接發(fā)生雙交換，最后斷裂的靶基因直接被敲除）l 位點(diǎn)特異性整合酶介導(dǎo)的基因組編輯：（cre/lox系統(tǒng)）利用兩次同源單交換分別將兩個(gè)loxP位點(diǎn)整合到目的基因片段的上下游，再將Cre蛋白表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入鏈霉菌，在Cre蛋白的作用下，兩個(gè)loxP位點(diǎn)發(fā)生位點(diǎn)特異性重組，完成目的基因片段的敲除。通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)SecI，SecI在18個(gè)堿基的位點(diǎn)（sceS）切斷基因組DNA，菌體不能夠存活。原理是構(gòu)建一個(gè)人工內(nèi)切酶，在預(yù)定的基因組位置切斷DNA，切斷的DNA在被細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生突變，從而達(dá)到改造基因組的目的。環(huán)境不斷改變，生物通過(guò)不斷突變而適應(yīng), 也就使其被保存下來(lái)。根據(jù)突變發(fā)生的方式，可分為自發(fā)突變和誘發(fā)突變。第1章 概論基因的符號(hào)：每個(gè)基因：如色氨酸基因trp；同一表型的不同基因：如trpA或trpB等。真核微生物：漢遜酵母，釀酒酵母，白念珠菌等。按突變體表型特征的不同，可把突變分為以下4個(gè)類型:1). 形態(tài)突變型2). 生化突變型3). 致死突變型:按突變所引起的遺傳信息的改變，又可把突變分為：1). 錯(cuò)義突變 2). 同義突變3). 無(wú)義突變 根據(jù)遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變，可分為堿基置換、移碼、DNA片段插入和缺失。所以，對(duì)整個(gè)生物群體來(lái)說(shuō)，突變使群體不會(huì)滅亡。 應(yīng)用于鏈霉菌基因組編輯與大片段DNA克隆的技術(shù)都有哪些？能否用在你們今后的實(shí)驗(yàn)中？（劉鋼老師） 基因組編輯是指在基因組水平上對(duì)DNA序列進(jìn)行改造的遺傳操作技術(shù)。如果發(fā)生同源單交換，該質(zhì)粒將被完整導(dǎo)入基因組靶位點(diǎn)。將該質(zhì)粒導(dǎo)入鏈霉菌，CRISPR/Cas9系統(tǒng)將靶位點(diǎn)切斷，同時(shí)質(zhì)粒上的同源臂與基因組上的同源臂發(fā)生雙交換，將斷裂的靶基因區(qū)刪除，基因組重新連接。再將pKC1139::attP6Dn導(dǎo)入SattB6，在40度培養(yǎng)， pKC1139::attP6Dn通過(guò)同源單交換整合到目的位置獲得SattB6P6。我們可以考慮使用基因編輯技術(shù)來(lái)進(jìn)行遺傳操做。首先是死亡的菌絲體并未顯示出PCD所特有的表觀特征，其次是死亡的菌絲體并未完全消失，保留的殘?bào)w既可以作為機(jī)械支撐用于氣生菌絲分化從而脫離培養(yǎng)基表面，同時(shí)也可作為水分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸通道。鏈霉菌發(fā)育分化中的細(xì)胞死亡過(guò)程其生理學(xué)意義可能在于：當(dāng)鏈霉菌在生長(zhǎng)過(guò)程中感受到環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)限制或者其它壓力時(shí)，通過(guò)細(xì)胞死亡可為其孢子形成提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，伴隨著基質(zhì)菌絲向氣生菌絲的轉(zhuǎn)變，鏈霉菌通常會(huì)在這一時(shí)期產(chǎn)生抗生素，這對(duì)于鏈霉菌專一性的重新利用自身裂解產(chǎn)物可能具有重要的意義。廣泛意義上的抗生素囊括了幾乎所有的微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物，這些次級(jí)代謝產(chǎn)物在極低的濃度在生化水平調(diào)控微生物的生長(zhǎng)過(guò)程。這對(duì)于鏈霉菌專一性的重新利用自身裂解產(chǎn)物可能具有重要的意義。在抗生素生物合成中調(diào)控基因起到了一個(gè)開關(guān)的作用, 它可決定一種抗生素能否被合成、什么時(shí)候合成和什么時(shí)候被終止的精細(xì)調(diào)控作用。2. 全局性調(diào)控：相對(duì)于鏈霉菌次級(jí)代謝中的其他調(diào)控模式而言，全局調(diào)控是一種更為多樣、普遍、復(fù)雜的調(diào)控模式。Eg. 雙組份信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)、AdpA3. 抗生素生物合成的自調(diào)控反饋調(diào)控和前饋調(diào)饋：（抗生素介導(dǎo)的自調(diào)控）反饋調(diào)控: 指一種微生物代謝反應(yīng)的終產(chǎn)物在代謝合成過(guò)程中對(duì)合成基因簇中調(diào)控基因或生化反應(yīng)關(guān)鍵酶基因的調(diào)控 (如抗生素)。鏈霉菌信號(hào)分子的類型：高絲氨酸內(nèi)酯(HSL)、自誘導(dǎo)肽(AIP)、AIγ丁酸內(nèi)酯(GBL)、DSF